Untersuchungen zur Lokalisation und Funktionsweise des Lantibiotika-Immunitätspeptids Pepl:
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2002
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| Edition: | [Mikrofiche-Ausg.] |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1
1.1 DEFINITION DES BEGRIFFS LANTIBIOTIKA 1
1.2 BIOSYNTHESE DER LANTIBIOTIKA 5
1.3 WIRKUNGSWEISE DER LANTIBIOTIKA 8
1.3.1 PORENBILDUNG DURCH TYP-A-LANTIBIOTIKA AN REINEN
PHOSPHOLIPIDMEMBRANEN 8
1.3.2 PORENBILDUNG DER TYP-A-LANTIBIOTIKA DURCH BINDUNG AN EIN
TARGET-MOLEKUEL 10
1.3.3 WEITERE WIRKUNGSWEISEN DER TYP-A-LANTIBIOTIKA 12
1.3.4 WIRKUNGSWEISE DER TYP-B-LANTIBIOTIKA 12
1.4 PRODUZENTENSELBSTSCHUTZ 13
1.5 ZIEL DER ARBEIT 16
2 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN 17
2.2 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE 18
2.3 ANZUCHT UND STAMMHALTUNG DER BAKTERIENSTAEMME 19
2.4 NAEHRMEDIEN 20
2.5 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 20
2.5.1 PLASMIDPRAEPARATION AUS
ESCHERICHIA COLI NACH FELICIELLO & CHINALI 20
2.5.2 SCHNELLVERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS STAPHYLOKOKKEN
NACH
BIRNBOIM & DOLY 21
2.5.3 PLASMIDPRAEPARATION MITTELS QIAPREP-SPIN-SAEULEN 21
2.6 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER KONZENTRATION UND REINHEIT VON DNA 21
2.7 ANALYSE VON DNA DURCH AGAROSEGELELEKTROPHORESE 21
2.8 DNA-ELUTION AUS AGAROSEGELEN 22
2.9 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA ZUR KLONIERUNG 22
2.10 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 22
2.11 REINIGUNG DER PCR-PRODUKTE 22
2.12 TRANSFORMATIONEN VON BAKTERIENZELLEN 22
2.12.1 PROTOPLASTENTRANSFORMATION VON
STAPHYIOCOCCUS CAMOSUS 23
2.12.2 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN VON
STAPHYIOCOCCUS EPIDERMIDIS 23
2.12.3 ELEKTROPORATION VON
STAPHYIOCOCCUS EPIDERMIDIS 23
2.12.4 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN VON
ESCHERICHIA COLI 23
2.12.5 ELEKTROPORATION VON
ESCHERICHIA COLI 24
2.13 SOUTHERN BLOT 24
2.13.1 DNA-TRANSFER UND HYBRIDISIERUNG 24
2.13.2 DIGOXIGENIN-VERMITTELTE DETEKTION 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/966535251
INHALTSVERZEICHNIS
2.14 DNA-SEQUENZIERUNG UND ANALYSE DER SEQUENZDATEN 25
2.15 HERSTELLUNG VON PROTOPLASTENMEMBRANEN 25
2.16 PRAEPARATION VON FUSIONSPROTEINEN AUS STAPHYLOKOKKEN 25
2.16.1 ZELLAUFSCHLUSS UND PROTEINAUFREINIGUNG UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN
26
2.16.2 PROTEINAUFREINIGUNG UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 26
2.16.3 PROTEINPRAEPARATION DURCH SDS-EXTRAKTION 27
2.16.4 PROTEINPRAEPARATION MIT LYSOSTAPHIN 27
2.17 PROTEINPRAEPARATION VON 6XHIS-FUSK NSPROTEINEN AUS
ESCHERICHIA COLI
27
2.17.1 ZELLAUFSCHLUSS UND PROTEINAUFREINIGUNG UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN
27
2.17.2 ZELLAUFSCHLUSS UND PROTEINAUFREINIGUNG UNTER DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN 28
2.18 PROTEINFAELLUNGEN 28
2.18.1 PROTEINFAELLUNG NACH WESSEL UND FLUEGGE 28
2.18.2 TRICHLORESSIGSAEURE (TCA)-FAELLUNG 29
2.19 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 29
2.20 WESTEM-BLOTTING 30
2.20.1 DETEKTION MIT ANTI-TETRA-HIS-ANTIKOERPER 30
2.20.2 DETEKTION MIT ANTI-TETRA-HIS-MEERRETTICHPEROXIDASE (HRP)-KONJUGAT
31
2.20.3 DETEKTION MIT ANTI-GFP-MEERRETTICHPEROXIDASE-(HRP)-KONJUGAT 31
2.21 GELFILTRATION 32
2.22 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PEP5 32
2.23 AUFREINIGUNG DES RADIOAKTIV MARKIERTEN PEP5 MITTELS REVERSED
PHASE-HPLC 33
2.24 PROTEINBESTIMMUNG MITTELS BICINCHONINSAEURE-(BCA)-TEST 34
2.25 PHOSPHATBESTIMMUNG 34
2.26 EXTRAKTION VON LIPIDEN 34
2.26.1 CHLOROFORM-METHANOL-EXTRAKTION 34
2.26.2 BUTANOL/PYRIDINACETAT-EXTRAKTION 35
2.27 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 35
2.28 NACHWEIS DER BINDUNG VON [
14C]-PEP5 AN PROTOPLASTENMEMBRANEN MITTELS
ZENTRIFUGATION 35
2.29 NACHWEIS DER BINDUNG VON [
14C]-PEP5 AN PROTOPLASTENMEMBRANEN MITTELS
FILTRATION 36
2.30 CARBOXYFLUORESCEIN-EFFLUX-EXPERIMENTE 36
2.30.1 HERSTELLUNG VON LIPOTEICHONSAEUREHALTIGEN UNILAMELLAREN LIPOSOMEN
36
2.30.2 HERSTELLUNG VON MULTILAMELLAREN LIPOSOMEN 38
2.31 BESTIMMUNG DER ANTIBIOTISCHEN AKTIVITAET VON PEPTIDEN 38
2.31.1 AGARDIFFUSIONSTEST 38
2.31.2 BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION (MHK) VON PEP5 38
INHALTSVERZEICHNIS
2.31.3 AKTIVITAETSTEST VON LACTOCIN S MITTELS AGARSTICHVERFAHREN 39
2.31.4 PEP5-ANTAGONISIERUNGSTEST 39
2.32 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 39
3 ERGEBNISSE
40
3.1 VERMITTLUNG VON KREUZIMMUNITAET ZWISCHEN LANTIBIOTIKAPRODUZENTEN 40
3.1.1 HETEROLOGE EXPRESSION VON
LASJ 40
3.1.2 BESTIMMUNG DER MHK VON PEP5 UND AKTIVITAETSTEST VON LACTOCIN S
MITTELS
AGARSTICHVERFAHREN GEGEN
STAPHYLOCOCCUS- UND LACTOBACILLUS-STAEMMEN 43
3.2 LOKALISATION DES IMMUNITAETSPEPTIDS PEPL 46
3.2.1 EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS PEPL-GFP 46
3.2.2 EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS ECIO-GFP 47
3.2.3 NACHWEIS DER PHAENOTYPISCHEN EXPRESSION DER IMMUNITAET 49
3.2.4 ZELLULAERE LOKALISATION DER GFP-FUSIONSPROTEINE MITTELS
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 50
3.2.5 NACHWEIS DER GFP-FUSIONSPROTEINE DURCH WESTEM-BLOT-ANALYSE 51
3.2.6 NACHWEIS DES 6XHIS-FUSIONSPROTEINS DURCH WESTEM-BLOT-ANALYSE 54
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM WIRKUNGS- UND SELBSTSCHUTZMECHANISMUS VON PEP5 55
3.3.1 GELFILTRATION 55
3.3.2 ANTAGONISIERUNG VON PEP5 57
3.3.2.1 PEP5-ANTAGONISIERUNGSTEST MIT PROTOPLASTENMEMBRANEN 58
3.3.2.2 PEP5-ANTAGONISIERUNGSTEST MIT LIPIDEXTRAKTEN AUS MEMBRANEN VON
S.
CAMOSUS TM300 59
3.3.3 AKTIVITAET VON PEP5 GEGEN LIPOTEICHONSAEURE-HALTIGE UNILAMELLARE
VESIKEL 60
3.3.4 AUFREINIGUNG VON [
14C]-MARKIERTEM PEP5 MITTELS HPLC 61
3.3.5 BINDUNGSSTUDIEN VON [
UC]-PEP5 AN PROTOPLASTENMEMBRANEN 62
3.3.5.1 NACHWEIS DER BINDUNG VON [
14C]-PEP5 AN PROTOPLASTENMEMBRANEN
DURCH DIE ZENTRIFUGATIONSMETHODE 62
3.3.5.2 NACHWEIS DER BINDUNG VON [
14C]-PEP5 AN PROTOPLASTENMEMBRANEN
VERSCHIEDENER BAKTERIENSTAEMME MITTELS FITTRATIONSMETHODE 63
3.3.6 BESTIMMUNG DER MHK VON 5D A1 UND DEN DEFENSINEN TBD UND HCOBD3 65
3.3.7 AUFREINIGUNG DES PEPL-6XHISTAG-FUSIONSPROTEINS UNTER NATIVEN
BEDINGUNGEN 66
4 DISKUSSION 68
4.1 LOKALISIERUNG DES IMMUNITAETSPEPTIDS PEPL 68
4.2 WIRKUNGSWEISE VON PEP5 70
4.3 WIRKUNGSWEISE DER IMMUNITAETSPEPTIDE 72
4.4 VERMITTLUNG VON KREUZIMMUNITAET 77
INHALTSVERZEICHNIS
5 ZUSAMMENFASSUNG
80
6 LITERATURVERZEICHNIS 82
7 ANHANG
88
7.1 ABBILDUNGEN UND TABELLEN 99
7.2 ABKUERZUNGEN 101 |
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