In-vitro-Untersuchung der Inhibition PDGF- und C-Kit-Rezeptor vermittelter Prozesse beim Ovarialkarzinom:
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| adam_text | Titel: In-vitro-Untersuchung der Inhibition PDGF- und C-Kit-Rezeptor vermittelter Prozesse beim Ovarialkarz
Autor: Stürner, Klarissa Hanja
Jahr: 2006
I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITEN
1. EINLEITUNG | - 2
II. MATERIAL UND METHODE 3 - 16
I .Zellkulturen 3
1.1 Zelllinien und Zellpflege 3
2. Rezeptornachweis 3 - 7
2.1 Vorbereitung der PCR 4
2.2 PCR-Protokolle der Rezeptor-Nachweise 4 - 7
2.2.) Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 6
2.2.2 Abl-Tyrosinkinase 6
2.2.3 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 6
2.2.4 PDGF-Rezeptortyrosinkinasen 7
2.3 Auswertung der PCR-Produkte 7
3. Immunhistochemischer Rezeptornachweis 8 - 10
3.1 Vorbereitung und Einbettung der Zellen 9
3.2 Auftragen des Ersten Antikörpers 9
3.3 Zweiter Antikörper und Entwicklung 10
3.4 Negativkontrolle 10
4. Proliferationsversuehe I! - 14
4.1 Medikamente 11
4.2 Durchführung der Proliferationsversuehe für die Monotherapie 11-12
4.3 Durchführung der Kombinationsversuche 12-13
4.4 Festlegung der Hemmkonzentration (IC -Werte) 13
4.5 Statistik 13 - 14
5. Apoptose zur Bestimmung der Zytotoxizität 14 - 16
5.1 Annexin V 14- 15
5.1.1 Prinzip des Annexin V - Apoptose-Nachweises 14- 15
5.1.2 Versuchsdurchführung 15
5.2 DNA- Fragmentationstest 15 - 16
5.2.1 Prinzip der „DNA-Strickleiter .15- 16
5.2.2 Versuchsdurchführung 16
II
III. ERGEBNISSE 16-47
1. Ergebnisse der PCR-Untersuchung 16-18
1.1 Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 16-17
1.2 Abl-Tyrosinkinase 16-17
1.3 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 16-17
1.4 PDGF-alpha und PDGF-beta-Rezeptortyrosinkinase 18
2. Ergebnisse der Immunhistochemischen Untersuchung 19 - 20
3. Ergebnisse der Proliferationsversuche 21 - 45
3.1 Imatinib - Monotherapie .21 -25
3.1.1 Festlegung der Inkubationszeit .21 - 22
3.1.2 Monotherapie mit Imatinib nach 72 Stunden 22 - 24
3.1.3 Imatinib mit taglichen Mediumwechsel nach 7 Tagen 24 - 25
3.2 Kombinationstherapie mit Imatinib .26 - 45
3.2.1 Kombinationstherapie Imatinib und Carboplatin 26 - 33
3.2.2 Kombinationstherapie Imatinib und Paclitaxel 34 - 40
3.2.3 Kombinationstherapie Imatinib und Carboplatin plus Paclitaxel. .40 - 45
4. Ergebnisse der Apoptoseuntersuchungen 46-47
IV. DISKUSSION 48 -60
l.PCR-Ergebnisse 48-51
1.1 Abl-Tyrosinkinase 48
1.2 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 49 - 50
1.3 PDGF-alpha und PDGF-beta-Rezeptortyrosinkinase 50 - 51
2. Immunhistochemische Untersuchungen 51
3. Proliferationsuntersuchungen 52 - 58
3.1 Monotherapie mit Imatinib 52
3.2 Kombinationstherapie mit Imatinib 53-54
3.3 Der AKT-Signalweg 54 - 5g
4. Apoptose 58
5. Ausblick: Möglichkeit eines klinischen Einsatzes von Imatinib 58 - 60
V.ZUSAMMENFASSUNG 61-62
VI. LITERATURVERZEICHNIS 63 - 71
III
VII. ANHANG 72-81
Auflistung der verwendeten Materialien und ihrer Herkunft 72 - 74
Tabelle 4: Eigenschaften der untersuchten Ovarialkarzinomzelllinien 75 - 76
Abkürzungsverzeichnis und Glossar 77 - 79
Danksagungen 80
Tabellarischer Lebenslauf 81 - 82
TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Prinzip des DAKO EnVision Systems 8
Tabelle 1:
Eigenschaften der Antikörper zum Nachweis von C-Kit, PDGF-alpha und PDGF-beta 9
Abb. 2: PCR-Ergebnis GIycerinaldehyd-3-Dehydrogenase 17
Abb. 3: PCR-Ergebnis Abl-Tyrosinkinase 17
Abb. 4: PCR-Ergebnis C-Kit-Tyrosinkinase 17
Abb. 5: PCR-Ergebnis PDGF-alpha-Rezeptor. 18
Abb. 6: PCR-Ergebnis PDGF-beta-Rezeptor 18
Abb. 7: Immunhistochemie - C-Kit bei der Zelllinie HEY: Negativ 20
Abb. 8: Immunhistochemie - C-Kit bei der Zelllinie SK-OV 3: Positiv 20
Abb. 9: Immunhistochemie - PDGF-alpha bei der Zelllinie BG-I: Positiv 20
Abb. 10: Immunhistochemie - PDGF-alpha bei der Zelllinie OVCAR 3: Positiv 20
Tabelle 2:
Monotherapie nach 72stündiger Inkubation 23
Tabelle 3:
Monotherapie mit Imatinib in Aqua ad inectabilia gelöst nach 7 Tagen
bei täglichem Mediumwechsel 25
Graph 1:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Carboplatin (IC50) und Imatinib in DMSO 27
Graph 2:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Carboplatin (IC50) und Imatinib in H20 29
Graph 3:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in DMSO (IC50) und Carboplatin 31
Graph 4:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in H2O (IC50) und Carboplatin 33
IV
Graph 5:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Paclitaxel (IC50) und Imatinib in DMSO 35
Graph 6:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Paclitaxel (IC50) und Imatinib in H20 37
Graph 7:
ZeUwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in DMSO (IC50) und Paclitaxel 39
Graph 8:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in H2O (IC50) und Paclitaxel 41
Graph 9:
Zetlwachstum unter Dreifachkombinationstherapie mit Imatinib in DMSO. 43
Graph 10:
Zellwachstum unter Dreifachkombinationstherapie mit Imatinib in H20 45
Abb. 11: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
IC50-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie HEY 47
Abb. 12: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) bei der Zelllinie HEY .47
Abb. 13: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
ICSO-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie OVCAR 3 47
Abb. 14: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) bei der Zelllinie OVCAR 3 .47
Abb. 15: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
IC50-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie SK-OV 3 47
Abb. 16: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) Imatinib bei der Zelllinie SK-OV 3 47
Abb. 17: Apoptoseuntersuchung DNA-Leiter als Nachweis später Apoptose 47
Abb. 18: Obersicht über den Akt-Signaltransduktionsweg 55
Tabelle 4: Eigenschaften der untersuchten Ovarialkarzinomzelllinien 75 - 76
|
| adam_txt |
Titel: In-vitro-Untersuchung der Inhibition PDGF- und C-Kit-Rezeptor vermittelter Prozesse beim Ovarialkarz
Autor: Stürner, Klarissa Hanja
Jahr: 2006
I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITEN
1. EINLEITUNG | - 2
II. MATERIAL UND METHODE 3 - 16
I .Zellkulturen 3
1.1 Zelllinien und Zellpflege 3
2. Rezeptornachweis 3 - 7
2.1 Vorbereitung der PCR 4
2.2 PCR-Protokolle der Rezeptor-Nachweise 4 - 7
2.2.) Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 6
2.2.2 Abl-Tyrosinkinase 6
2.2.3 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 6
2.2.4 PDGF-Rezeptortyrosinkinasen 7
2.3 Auswertung der PCR-Produkte 7
3. Immunhistochemischer Rezeptornachweis 8 - 10
3.1 Vorbereitung und Einbettung der Zellen 9
3.2 Auftragen des Ersten Antikörpers 9
3.3 Zweiter Antikörper und Entwicklung 10
3.4 Negativkontrolle 10
4. Proliferationsversuehe I! - 14
4.1 Medikamente 11
4.2 Durchführung der Proliferationsversuehe für die Monotherapie 11-12
4.3 Durchführung der Kombinationsversuche 12-13
4.4 Festlegung der Hemmkonzentration (IC -Werte) 13
4.5 Statistik 13 - 14
5. Apoptose zur Bestimmung der Zytotoxizität 14 - 16
5.1 Annexin V 14- 15
5.1.1 Prinzip des Annexin V - Apoptose-Nachweises 14- 15
5.1.2 Versuchsdurchführung 15
5.2 DNA- Fragmentationstest 15 - 16
5.2.1 Prinzip der „DNA-Strickleiter" .15- 16
5.2.2 Versuchsdurchführung 16
II
III. ERGEBNISSE 16-47
1. Ergebnisse der PCR-Untersuchung 16-18
1.1 Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 16-17
1.2 Abl-Tyrosinkinase 16-17
1.3 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 16-17
1.4 PDGF-alpha und PDGF-beta-Rezeptortyrosinkinase 18
2. Ergebnisse der Immunhistochemischen Untersuchung 19 - 20
3. Ergebnisse der Proliferationsversuche 21 - 45
3.1 Imatinib - Monotherapie .21 -25
3.1.1 Festlegung der Inkubationszeit .21 - 22
3.1.2 Monotherapie mit Imatinib nach 72 Stunden 22 - 24
3.1.3 Imatinib mit taglichen Mediumwechsel nach 7 Tagen 24 - 25
3.2 Kombinationstherapie mit Imatinib .26 - 45
3.2.1 Kombinationstherapie Imatinib und Carboplatin 26 - 33
3.2.2 Kombinationstherapie Imatinib und Paclitaxel 34 - 40
3.2.3 Kombinationstherapie Imatinib und Carboplatin plus Paclitaxel. .40 - 45
4. Ergebnisse der Apoptoseuntersuchungen 46-47
IV. DISKUSSION 48 -60
l.PCR-Ergebnisse 48-51
1.1 Abl-Tyrosinkinase 48
1.2 C-Kit-Rezeptortyrosinkinase 49 - 50
1.3 PDGF-alpha und PDGF-beta-Rezeptortyrosinkinase 50 - 51
2. Immunhistochemische Untersuchungen 51
3. Proliferationsuntersuchungen 52 - 58
3.1 Monotherapie mit Imatinib 52
3.2 Kombinationstherapie mit Imatinib 53-54
3.3 Der AKT-Signalweg 54 - 5g
4. Apoptose 58
5. Ausblick: Möglichkeit eines klinischen Einsatzes von Imatinib 58 - 60
V.ZUSAMMENFASSUNG 61-62
VI. LITERATURVERZEICHNIS 63 - 71
III
VII. ANHANG 72-81
Auflistung der verwendeten Materialien und ihrer Herkunft 72 - 74
Tabelle 4: Eigenschaften der untersuchten Ovarialkarzinomzelllinien 75 - 76
Abkürzungsverzeichnis und Glossar 77 - 79
Danksagungen 80
Tabellarischer Lebenslauf 81 - 82
TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Prinzip des DAKO EnVision Systems 8
Tabelle 1:
Eigenschaften der Antikörper zum Nachweis von C-Kit, PDGF-alpha und PDGF-beta 9
Abb. 2: PCR-Ergebnis GIycerinaldehyd-3-Dehydrogenase 17
Abb. 3: PCR-Ergebnis Abl-Tyrosinkinase 17
Abb. 4: PCR-Ergebnis C-Kit-Tyrosinkinase 17
Abb. 5: PCR-Ergebnis PDGF-alpha-Rezeptor. 18
Abb. 6: PCR-Ergebnis PDGF-beta-Rezeptor 18
Abb. 7: Immunhistochemie - C-Kit bei der Zelllinie HEY: Negativ 20
Abb. 8: Immunhistochemie - C-Kit bei der Zelllinie SK-OV 3: Positiv 20
Abb. 9: Immunhistochemie - PDGF-alpha bei der Zelllinie BG-I: Positiv 20
Abb. 10: Immunhistochemie - PDGF-alpha bei der Zelllinie OVCAR 3: Positiv 20
Tabelle 2:
Monotherapie nach 72stündiger Inkubation 23
Tabelle 3:
Monotherapie mit Imatinib in Aqua ad inectabilia gelöst nach 7 Tagen
bei täglichem Mediumwechsel 25
Graph 1:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Carboplatin (IC50) und Imatinib in DMSO 27
Graph 2:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Carboplatin (IC50) und Imatinib in H20 29
Graph 3:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in DMSO (IC50) und Carboplatin 31
Graph 4:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in H2O (IC50) und Carboplatin 33
IV
Graph 5:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Paclitaxel (IC50) und Imatinib in DMSO 35
Graph 6:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Paclitaxel (IC50) und Imatinib in H20 37
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ZeUwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in DMSO (IC50) und Paclitaxel 39
Graph 8:
Zellwachstum unter Kombinationstherapie Imatinib in H2O (IC50) und Paclitaxel 41
Graph 9:
Zetlwachstum unter Dreifachkombinationstherapie mit Imatinib in DMSO. 43
Graph 10:
Zellwachstum unter Dreifachkombinationstherapie mit Imatinib in H20 45
Abb. 11: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
IC50-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie HEY 47
Abb. 12: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) bei der Zelllinie HEY .47
Abb. 13: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
ICSO-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie OVCAR 3 47
Abb. 14: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) bei der Zelllinie OVCAR 3 .47
Abb. 15: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
IC50-Konzentration Imatinib bei der Zelllinie SK-OV 3 47
Abb. 16: Apoptoseuntersuchung AnnexinV
Kontrolle (DMSO) Imatinib bei der Zelllinie SK-OV 3 47
Abb. 17: Apoptoseuntersuchung DNA-Leiter als Nachweis später Apoptose 47
Abb. 18: Obersicht über den Akt-Signaltransduktionsweg 55
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