Untersuchungen zur molekularen Regulation der Transkription des humanen b-Defensin-2 [Beta-Defensin-2] in epidermalen Keratinozyten:
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|---|---|
| adam_text | Inhalt
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Material und Methoden 5
2.1 Verwendete Chemikalien, allgemeine Erläuterungen 5
2.2 Bakterienkulturen und Nährmedien 5
2.2.1 Nährmedien für Kulturen von Mikroorganismen 5
2.2.2 Überblick über die verwendeten Bakterienstämme 6
2.3 Anzucht von Mikroorganismen und Aufarbeitung von Kulturüberständen 6
2.3.1 Kultivierung der Mikroorganismen zur Gewinnung von Kulturüberständen 6
2.3.2 Einkonzentrierung der Bakterienkulturüberstände 7
2.4 Erstellung der Vektorkonstrukte für Transfektionsversuche 7
2.4.1 Verwendetes Reporter Plasmid: pGL3 Control Vektor 7
2.4.1.1 Verwendete Oligonukleotide (Primer) im pGL3 Control Vektor 8
2.4.2 Verwendete Oligonukleotide (Primer) zur Erstellung von Promotorfragmenten.... 8
2.4.3 Verwendete Promotorfragmente und erstellte Promotor Vektor Konstrukte 9
2.4.4 Amplifikation der Promotorfragmente aus genomischer DNA 9
2.4.5 Schneiden der Promotorfragmente und des Vektors 10
2.4.6 Ligation von Vektor und Promotorfragmenten 10
2.4.7 Transformation und Ausplattierung von Bakterien 11
2.4.8 PCR zur Überprüfung einer erfolgreichen Klonierung (Kolonie PCR) 11
2.4.9 DNA Sequenzierung 12
2.5 Humane Zelllinien 13
2.5.1 Zellkultur 13
2.5.1.1 HaCaT Zelllinie, A431 Zelllinie und KB Zelllinie 13
2.5.1.2 Isolierung und Kultivierung primärer humaner Keratinozyten 14
2.5.1.3 Kollagenbeschichtung von Kulturflaschen und 12 Loch Kultur Platten 14
2.5.1.4 Subkultivierung der HaCaT Zellen und primären Keratinozyten 15
2.5.1.5 Einfrieren und Auftauen von adhärent wachsenden Zellen 15
2.5.2 Transfektron von Zellen 16
2.5.3 Signalweg Inhibierungen 17
2.5.4 Stimulation von Zellen 17
2.6 Semiquantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion 18
2.6.1 Verwendete Oligonukleotide (Primer) 18
2.6.2 RNA Isolierung 19
2.6.3 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 19
2.6.4 Reverse Transkription (cDNA Synthese) 19
2.6.5 Realtime Polymerase Kettenreaktion (Realtime PCR) 20
2.7 Luziferase Reporter Gen Experimente 21
2.7.1 Allgemeines Prinzip 21
2.7.2 Durchführung der Luziferase Messung 21
2.8 Darstellung der Ergebnisse 22
3 Ergebnisse 23
3.1 Untersuchungen zur hBD 3 mRNA lnduktion 23
3.1.1 HBD 3 mRNA in primären humanen Keratinozyten 23
3.1.1.1 Die hBD 3 Gen Expression ist in primären Keratinozyten induzierbar 23
3.1.1.2 Die hBD 3 mRNA lnduktion in primären Keratinozyten ist abhängig
von der Zellkonfluenz 24
3.1.1.3 Ditferenzielle zeitabhängige hBD 2 und hBD 3 mRNA lnduktion in
primären Keratinozyten 25
3.1.1.4 HBD 3 mRNA wird durch IFN y und PMAauch indirekt induziert 26
3.1.1.5 HBD 3 lnduktoren von P. aeruginosa besitzen Molekularmassen von
mehr als 30 kD 27
3.1.2 HBD 3 mRNA in HaCat Zellen und anderen epithelialen Zelllinien 28
3.2 Charakterisierung des hBD 3 Promotors 29
3.2.1 Differenzielle Aktivierung des hBD 3 Promotors 31
3.2.2 Bedeutung verschieden langer hBD 3 Promotorfragmente 32
3.3 Untersuchungen zur Inhibition der hBD 3 mRNA lnduktion 33
3.3.1 Retinol inhibiert die differenzielle Gen Induktion von hBD 3 33
3.3.2 Differenzieller Effekt der NF KB Inhibtion auf die P. aeruginosa und PMA
vermittelte Geninduktion von hBD 3 und IL 8 33
3.3.3 Die Inhibition von MAP Kinase Signalwegen blockiert die P. aeruginosa
und PMA abhängige hBD 3 mRNA lnduktion 34
4 Diskussion 36
4.1 HBD 3 ein antimikrobielles Peptid der menschlichen Haut 36
4.2 Charakterisierung der Regulation der hBD 3 Expression 37
4.2.1 In wVo Expression von hBD 3 37
4.2.2 In wfro Expression von hBD 3: Induktion durch verschiedene Stimuli 38
4.2.3 In wfro Expression von hBD 3: Abhängigkeit von verschiedenen
Zelllinien, von der Zelldichte und der Differenzierung 41
4.3 AP 1 Beteiligung an der hBD 3 Expression 43
4.4 NF KB Beteiligung an der hBD 3 Expression 45
4.5 AP 1, NF kB , STAT 1 und die hBD 3 Expression 46
4.6 HBD 2/ 3 im Vergleich 48
4.7 Wirkmechanismus des hBD 3 55
4.8 Therapeutische Aspekte und Ausblick 56
5 Zusammenfassung 59
6 Literaturverzeichnis 61
7 Danksagung 72
8 Lebenslauf 73
|
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Inhalt
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Material und Methoden 5
2.1 Verwendete Chemikalien, allgemeine Erläuterungen 5
2.2 Bakterienkulturen und Nährmedien 5
2.2.1 Nährmedien für Kulturen von Mikroorganismen 5
2.2.2 Überblick über die verwendeten Bakterienstämme 6
2.3 Anzucht von Mikroorganismen und Aufarbeitung von Kulturüberständen 6
2.3.1 Kultivierung der Mikroorganismen zur Gewinnung von Kulturüberständen 6
2.3.2 Einkonzentrierung der Bakterienkulturüberstände 7
2.4 Erstellung der Vektorkonstrukte für Transfektionsversuche 7
2.4.1 Verwendetes Reporter Plasmid: pGL3 Control Vektor 7
2.4.1.1 Verwendete Oligonukleotide (Primer) im pGL3 Control Vektor 8
2.4.2 Verwendete Oligonukleotide (Primer) zur Erstellung von Promotorfragmenten. 8
2.4.3 Verwendete Promotorfragmente und erstellte Promotor Vektor Konstrukte 9
2.4.4 Amplifikation der Promotorfragmente aus genomischer DNA 9
2.4.5 Schneiden der Promotorfragmente und des Vektors 10
2.4.6 Ligation von Vektor und Promotorfragmenten 10
2.4.7 Transformation und Ausplattierung von Bakterien 11
2.4.8 PCR zur Überprüfung einer erfolgreichen Klonierung (Kolonie PCR) 11
2.4.9 DNA Sequenzierung 12
2.5 Humane Zelllinien 13
2.5.1 Zellkultur 13
2.5.1.1 HaCaT Zelllinie, A431 Zelllinie und KB Zelllinie 13
2.5.1.2 Isolierung und Kultivierung primärer humaner Keratinozyten 14
2.5.1.3 Kollagenbeschichtung von Kulturflaschen und 12 Loch Kultur Platten 14
2.5.1.4 Subkultivierung der HaCaT Zellen und primären Keratinozyten 15
2.5.1.5 Einfrieren und Auftauen von adhärent wachsenden Zellen 15
2.5.2 Transfektron von Zellen 16
2.5.3 Signalweg Inhibierungen 17
2.5.4 Stimulation von Zellen 17
2.6 Semiquantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion 18
2.6.1 Verwendete Oligonukleotide (Primer) 18
2.6.2 RNA Isolierung 19
2.6.3 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 19
2.6.4 Reverse Transkription (cDNA Synthese) 19
2.6.5 Realtime Polymerase Kettenreaktion (Realtime PCR) 20
2.7 Luziferase Reporter Gen Experimente 21
2.7.1 Allgemeines Prinzip 21
2.7.2 Durchführung der Luziferase Messung 21
2.8 Darstellung der Ergebnisse 22
3 Ergebnisse 23
3.1 Untersuchungen zur hBD 3 mRNA lnduktion 23
3.1.1 HBD 3 mRNA in primären humanen Keratinozyten 23
3.1.1.1 Die hBD 3 Gen Expression ist in primären Keratinozyten induzierbar 23
3.1.1.2 Die hBD 3 mRNA lnduktion in primären Keratinozyten ist abhängig
von der Zellkonfluenz 24
3.1.1.3 Ditferenzielle zeitabhängige hBD 2 und hBD 3 mRNA lnduktion in
primären Keratinozyten 25
3.1.1.4 HBD 3 mRNA wird durch IFN y und PMAauch indirekt induziert 26
3.1.1.5 HBD 3 lnduktoren von P. aeruginosa besitzen Molekularmassen von
mehr als 30 kD 27
3.1.2 HBD 3 mRNA in HaCat Zellen und anderen epithelialen Zelllinien 28
3.2 Charakterisierung des hBD 3 Promotors 29
3.2.1 Differenzielle Aktivierung des hBD 3 Promotors 31
3.2.2 Bedeutung verschieden langer hBD 3 Promotorfragmente 32
3.3 Untersuchungen zur Inhibition der hBD 3 mRNA lnduktion 33
3.3.1 Retinol inhibiert die differenzielle Gen Induktion von hBD 3 33
3.3.2 Differenzieller Effekt der NF KB Inhibtion auf die P. aeruginosa und PMA
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3.3.3 Die Inhibition von MAP Kinase Signalwegen blockiert die P. aeruginosa
und PMA abhängige hBD 3 mRNA lnduktion 34
4 Diskussion 36
4.1 HBD 3 ein antimikrobielles Peptid der menschlichen Haut 36
4.2 Charakterisierung der Regulation der hBD 3 Expression 37
4.2.1 In wVo Expression von hBD 3 37
4.2.2 In wfro Expression von hBD 3: Induktion durch verschiedene Stimuli 38
4.2.3 In wfro Expression von hBD 3: Abhängigkeit von verschiedenen
Zelllinien, von der Zelldichte und der Differenzierung 41
4.3 AP 1 Beteiligung an der hBD 3 Expression 43
4.4 NF KB Beteiligung an der hBD 3 Expression 45
4.5 AP 1, NF kB , STAT 1 und die hBD 3 Expression 46
4.6 HBD 2/ 3 im Vergleich 48
4.7 Wirkmechanismus des hBD 3 55
4.8 Therapeutische Aspekte und Ausblick 56
5 Zusammenfassung 59
6 Literaturverzeichnis 61
7 Danksagung 72
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