Untersuchungen zu Mechanismen der ernährungsbedingten Kolonkarzinogenese: genspezifische Schäden in humanen Kolonzellen durch endogene Risikofaktoren
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
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2004
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
V
TABELLENVERZEICHNIS
.
IX
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
XI
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
ERNAEHRUNG
UND
KREBS
.
1
1.2
KOLONKARZINOGENESE
.
2
1.2.1
SPORADISCHER
KOLOREKTALKREBS
.
2
1.2.2
ADENOM-KARZINOM-SEQUENZ
.
4
1.2.3
ZIELGENE
DER
KOLONKARZINOGENESE
.
6
1.2.3.1
APC-GEN
.
6
1.2.3.2
KRAS-GEN
.
7
1.2.3.3
TP53-GEN
.
8
1.2.4
KOLONKARZINOGENESE:
BOTTOM-UP
ODER
TOP-DOWN?
.
9
1.3
KOLONGEWEBE,
KOLONKRYPTEN
UND
KOLONZELLEN
.
_
.
_
.
_
.10
1.3.1
KOLONGEWEBE
UND
KOLONKRYPTEN
.
10
1.3.2
KOLONKRYPTEN
UND
STAMMZELLEN
.
10
1.3.3
KOLOREKTALE
PRIMAERZELLEN
UND
KOLONZELLLINIEN
.
11
1.4
INDUKTION,
REPARATUR
UND
ERFASSUNG
VON
DNS-SCHAEDEN
.
12
1.4.1
INDUKTION
VON
DNS-SCHAEDEN
.
12
1.4.1.1
OXIDATIVER
STRESS
.
13
1.4.1.2
LIPIDPEROXIDATION
.
14
1.4.2
REPARATUR
VON
DNS-SCHAEDEN
.
16
1.4.3
ERNAEHRUNG,
OXIDATIVER
STRESS,
LIPIDPEROXIDATION
UND
GENSPEZIFISCHE
DNS-SCHAEDEN
.
18
1.4.4
ERFASSUNG
VON
DNS-SCHAEDEN
.
22
1.4.4.1
COMET-ASSAY:
SCHAEDEN
IN
DER
GESAMT-DNS
.
22
1.4.4.2
COMET-FISH:
SCHAEDEN
IN
SPEZIFISCHEN
GENOMABSCHNITTEN
.
24
1.4.4.3
GENSPEZIFISCHE
SCHAEDEN
UND
GENAKTIVITAET
.
25
2
PROBLEM
UND
ZIELSTELLUNG
.
26
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
28
3.1
MATERIAL
.
28
3.1.1
HUMANE
KOLONZELLEN
.
28
3.1.1.1
ZELLLINIEN
.
28
3.1.1.1.1
HT29CLONEL9A-KOLONKARZINOMZELLEN
.
28
3.1.1.1.2
LT97-KOLONADENOMZELLEN
.
28
I
NHALTSVERZEICHNIS
II
3.1.1.2
PRIMAERMATERIAL
AUS
KOLONGEWEBEPROBEN
.
28
3.1.1.2.1
HUMANE
KOLONBIOPSIEN
.
28
3.1.1.2.2
HUMANES
KOLONGEWEBE
.
28
3.1.2
TESTSUBSTANZEN
.
29
3.1.2.1
WASSERSTOFFPEROXID
.
29
3.1.2.2
TRANS-2-HEXENAL
.
29
3.1.2.3
4-HYDROXY-2-NONENAL
.
29
3.1.3
DNS-SONDEN
.
29
3.1.3.1
KOMMERZIELLE
SONDEN
.
29
3.1.3.2
NICHT-KOMMERZIELLE
SONDEN
.
30
3.1.4
SONSTIGES
.
30
3.2
METHODEN
_
.
------------
.
-----------
.
--------
.
--------
.
--------
.
----------------
30
3.2.1
ARBEITEN
MIT
KOLONZELLLINIEN
.
30
3.2.1.1
HT29CLONEL9A-KOLONKARZINOMZELLEN
.
30
3.2.1.2
LT97-KOLONADENOMZELLEN
.
31
3.2.2
AUFARBEITUNG,
AUFBEWAHRUNG
UND
AUFREINIGUNG
HUMANER
KOLONGEWEBEPROBEN
.
32
3.2.2.1
AUFARBEITUNG
VON
KOLONBIOPSIEN
.
32
3.2.2.2
AUFARBEITUNG
VON
KOLONGEWEBE
.
33
3.2.2.3
AUFBEWAHRUNG
VON
PRIMAERMATERIAL
.
33
3.2.2.4
AUFREINIGUNG
DER
PRIMAERZELLSUSPENSIONEN
.
34
3.2.3
BESTIMMUNG
VON
ZELLZAHL
UND
ZELLVITALITAET
.
36
3.2.3.1
ZELLZAHL
UND
ZELLVITALITAET
MIT
TRYPANBLAU
.
36
3.2.3.2
VITALITAET
MIT
FLUORESCEINDIACETAT/ETHIDIUMBROMID
.
36
3.2.3.3
VITALITAET
MIT
FLUORESCEINDIACETAT/TRYPANBLAU
.
37
3.2.4
BESTIMMUNG
DER
APOPTOSE
MIT
ANNEXIN
V-FITC
.
37
3.2.5
ANSETZEN
DER
TESTSUBSTANZEN
(H2O2,
HEXENAL
UND
HNE)
.
38
3.2.6
HERSTELLUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
HNE
.
38
3.2.7
INDUKTION
UND
REPARATUR
VON
DNS-SCHAEDEN
.
39
3.2.7.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-ZUSAMMENHAENGE
.
39
3.2.7.2
REPARATURVERSUCHE
.
40
3.2.8
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROPANO-DG-ADDUKTEN
.
41
3.2.9
GENOTOXIZITAETSTESTS
.
41
3.2.9.1
NACHWEIS
GENOTOXISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-ASSAY
.
42
3.2.9.2
NACHWEIS
GENSPEZIFISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-FISH
.
44
3.2.10
KARYOTYPISIERUNG
DER
HT29CLONEL9A
UND
LT97-ZELLEN
MITTELS
24-FARBEN-FISH
.
47
3.2.11
STATISTIK
.
47
4
ERGEBNISSE
.
48
4.1
AUFARBEITUNG,
AUFBEWAHRUNG
UND
AUFREINIGUNG
HUMANER KOLONGEWEBEPROBEN
.48
4.1.1
AUFARBEITUNG
VON
KOLONBIOPSIEN
UND
KOLONGEWEBE
.
48
4.1.1.1
KOLONBIOPSIEN
.
48
4.1.1.1.1
GEWINNUNG
VON
KOLONKRYPTEN
.
48
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
4.1.1.1.2
GEWINNUNG
VON
PRIMAEREN
KOLONZELLEN
.
48
4.1.1.2
KOLONGEWEBE
.
49
4.1.1.2.1
GEWINNUNG
VON
KOLONEPITHELSTREIFEN
.
49
4.1.1.2.2
GEWINNUNG
VON
KOLONKRYPTEN
.
49
4.1.1.2.3
GEWINNUNG
VON
PRIMAEREN
KOLONZELLEN
.
50
4.1.1.3
VERGLEICH
DER
AUFARBEITUNG
VON
KOLONBIOPSIEN
UND
KOLONGEWEBE
.
50
4.1.2
AUFBEWAHRUNG
VON
PRIMAERMATERIAL
.
51
4.1.2.1
KURZFRISTIGE
AUFBEWAHRUNG
.
51
4.1.2.1.1
AUFBEWAHRUNG
VON
PRIMAEREN
KOLONZELLEN
.
51
4.1.2.1.2
AUFBEWAHRUNG
VON
KOLONKRYPTEN
.
51
4.1.2.1.3
AUFBEWAHRUNG
VON
KOLONEPITHELSTREIFEN
.
51
4.1.2.2
LANGFRISTIGE
AUFBEWAHRUNG
.
51
4.1.2.2.1
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
PRIMAEREN
KOLONZELLEN
.
51
4.1.2.2.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
KOLONEPITHELSTREIFEN
.
52
4.1.3
EINFLUSS
VON
AUFARBEITUNG
UND
AUFREINIGUNG
AUF
VITALITAET
UND
DNS-BASISSCHAEDEN
.
54
4.1.3.1
DAUER
DES
ENZYMVERDAUS
.
54
4.1.3.2
ERYTHROZYTENLYSE
UND
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
55
4.1.3.3
MAGNETISCHE
ZELLSEPARATION
.
57
4.1.4
BESTIMMUNG
VON
VITALITAET
UND
APOPTOSE
.
58
4.1.4.1
VERGLEICHENDE
TOT-VITAL-FAERBUNGEN
IN
PRIMAEREN
KOLONZELLEN
UND
KRYPTEN
.
58
4.1.4.2
BESTIMMUNG
DER
APOPTOSE
IN
KOLONKRYPTEN
MIT
ANNEXIN
V-FITC
.
60
4.2
NACHWEIS
GENOTOXISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-ASSAY
.
60
4.2.1
HT29CLONEL9A-KOLONKARZINOMZELLEN
.
60
4.2.1.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-ZUSAMMENHAENGE
.
60
4.2.1.2
REPARATUR
DER
DNS-SCHAEDEN
.
61
4.2.2
PRIMAERE
KOLONZELLEN
.
63
4.2.2.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-ZUSAMMENHAENGE
.
63
4.2.2.2
REPARATUR
DER
DNS-SCHAEDEN
.
64
4.2.3
LT97-ZELLEN
.
66
4.2.3.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-ZUSAMMENHAENGE
.
66
4.2.3.2
REPARATUR
DER
DNS-SCHAEDEN
.
67
4.2.4
VERGLEICH
DER
TESTSUBSTANZEN
.
68
4.2.4.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-ZUSAMMENHAENGE
.
68
4.2.4.2
REPARATURVERSUCHE
.
68
4.2.5
VERGLEICH
DER
VERWENDETEN
ZELLEN
.
68
4.2.5.1
HT29CLONEL9A
UND
LT97-ZELLEN
.
68
4.2.5.2
HT29CLONEL9A-,
LT97
UND
PRIMAERZELLEN
.
70
4.2.6
UNTERSUCHUNG
DES
LOESUNGSMITTELEINFLUSSES
AUF
HNE-INDUZIERTE
DNS-SCHAEDEN
.
71
4.2.7
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REPARATUR
HNE-INDUZIERTER
DNS-SCHAEDEN:
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROPANO-DNS
ADDUKTEN
.
72
4.2.8
UNTERSUCHUNG
H2O2
BZW.
HNE
INDUZIERTER
SCHAEDEN
IM
ALKALISCHEN
UND
NEUTRALEN
COMET-ASSAY
.
73
4.2.9
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
DER
ZELLWACHSTUMSDAUER
AUF
HEXENAL-INDUZIERTE
DNS-SCHAEDEN
.
75
I
NHALTSVERZEICHNIS
IV
4.3
NACHWEIS
GENSPEZIFISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-FISH
.
76
4.3.1
KARYOTYPISIERUNG
DER
HT29CLONEL9A
UND
LT97-ZELLEN
.
76
4.3.1.1
HT29CLONE
1
9A-KOLONKARZINOMZELLEN
.
77
4.3.1.2
LT97-KOLONADENOMZELLEN
.
77
4.3.2
GENERELLE
DNS-SCHAEDEN
IN
DEN
COMET-FISH-VERSUCHEN
.
78
4.3.3
HYBRIDISIERUNGSEFFIZIENZ
IN
DEN
COMET-FISH-VERSUCHEN
.
80
4.3.4
LOKALISIERUNG
DER
FISH-SIGNALE
INNERHALB
DER
ZELLEN
.
80
4.3.5
SPEZIFISCHE
SCHAEDEN
IM
APC-,
KRAS
BZW.
TP53-GEN
.
81
4.3.5.1
PRIMAERE
KOLONZELLEN
.
81
4.3.5.2
LT97-KOLONADENOMZELLEN
.
88
4.3.5.3
ZUSAMMENFASSUNG
.
94
4.3.6
VERGLEICH
DER
UNTERSUCHTEN
GENE
.
95
4.3.7
VERGLEICH
DER
VERWENDETEN
ZELLEN
.
98
4.3.8
GEBROCHENE
SIGNALE
IN
DEN
COMET-FISH-VERSUCHEN
.
101
4.3.9
ZWEI-FARBEN
UND
DREI-FARBEN-FISH-VERSUCHE
.
102
4.3.10
COMET-FISH-VERSUCHE
MIT
GANZCHROMOSOMENPROBEN
.
103
5
DISKUSSION
.104
5.1
ZELL
UND
KRYPTISOLIERUNG
AUS
GEWEBEPROBEN
.104
5.2
NACHWEIS
GENOTOXISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-ASSAY
.
111
5.3
NACHWEIS
GENSPEZIFISCHER
EFFEKTE
MITTELS
COMET-FISH
.
122
6
SCHLUSSFOLGERUNGEN
UND
AUSBLICK
.
130
6.1
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
130
6.2
AUSBLICK
.
133
7
ZUSAMMENFASSUNG
.136
LITERATURVERZEICHNIS
.139
ANHANG
.153
ANHANG
I:
MATERIAL
.
153
ANHANG
II:
TABELLEN
.159
ANHANG
HI:
ABBILDUNGEN
.167 |
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