Isolierung und Charakterisierung immunmodulierender Proteine aus Thuja occidentalis L.:
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2002
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5
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 10
PATENTRECHTLICHE ANMERKUNG 12
1. EINLEITUNG 13
1.1 DAS MENSCHLICHE IMMUNSYSTEM 13
1.2 PFLANZEN MIT IMMUNMODULIERENDER WIRKUNG 16
1.3 DER ABENDLAENDISCHE LEBENSBAUM
THUJA OCCIDENTALIS 18
1.4 GRUNDLAGEN UND FRAGESTELLUNG DER EXPERIMENTE 20
2. MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 HERSTELLUNG DER RETENTATE 21
2.2 TPSG-EXTRAKTION 22
2.3 GLYKOPROTEINEXTRAKTION AUS
THUJA OCCIDENTALIS 23
2.4 GESAMTPROTEIN AUS
T. OCCIDENTALIS 24
2.5 AMMONIUMSULFATFALLUNGEN DER RETENTATE 24
2.6 LYOPHILISIERUNG 25
2.7 PROTEINBESTIMMUNG 25
2.8 SDS-PAGE 26
2.8.1 EINDIMENSIONALE SDS-PAGE 26
2.8.2 2-D-SDS-PAGE 26
2.9 SILBERFAERBUNG 27
2.9.1 SILBERFAERBUNG NACH
HEUKESHOVEN
UND
DERNICK(1985)
27
2.9.2 ENTFAERBEN MIT YYFARMERS-REDUCER" 28
2.10 YYWESTERN-BLOT" 28
2.10.1 PROTEINTRANSFER 28
2.10.2 PONCEAUS-FAERBUNG 29
2.10.3 COOMASSIE-FAERBUNG 29
2.10.4 AMIDOSCHWARZ-FAERBUNG 29
2.10.5 IMMUNDETEKTION 30
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/967852625
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.10.6 ,31OTSTRIPPING" 31
2.11 GLYKOSYLIERUNGSNACHWEISE 31
2.12 RNA-EXTRAKTION 31
2.13 YYNORTHEM-BLOT" 32
2.13.1 RNA-AGAROSE-GEL 32
2.13.2 RNA-TRANSFER 33
2.13.3 SONDENMARKIERUNG 33
2.13.4 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION 34
2.14 CDNA-BANK-SYNTHESE 34
2.14.1 MRNA-ISOLIERUNG 34
2.14.2 KLONIERUNG DER CDNA-BANK 34
2.15 PROLIFERATIONS-AKTIVITAETSTESTS 3 5
2.15.1 ISOLIERUNG DER PBMCS 3 5
2.15.2 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL MIT TRYPANBLAU 36
2.15.3 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON PBMCS 36
2.15.4 BESTRAHLEN VON PBMCS 37
2.15.5 PROLIFERATIONSASSAY MIT BRDU 37
2.15.6 PROLIFERATIONSASSAY MIT
3H-THYMIDIN 37
2.15.7 SEKUNDAERSTIMULATION 3 8
2.16 PROTEINASE K-VERDAU DER RETENTATPROTEINE 39
2.17 ANTIKOERPERGENERIERUNG 39
2.18 KOMPETENTE
E. COLI-ZELLEN 40
2.19 KULTUR VON
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 41
2.20 TRANSFORMATION VON S. CEREVISIAE 42
2.21 HEFE-ANTIKOERPER-SCREENING 43
2.22 DNA-EXTRAKTION AUS
S. CEREVISIAE UND YYPLASMID RESCUE" 44
2.23 PROTEINSEQUENZIERUNG 43
2.24 PCR 44
2.24.1 PRIMER 45
2.24.2 PCR-REAKTIONSANSAETZE 47
2.25 RESTRIKTIONSANSAETZE 48
2.26 DNA-GELE 48
2.27 KOLONIE-HYBRIDISIERUNG MIT DNA-SONDEN 48
2.28 DNA-SEQUENZIERUNG 48
7
INHALTSVERZEICHNIS
2.29 SEQUENZANALYSEN 48
2.30 GEN-EXPRESSION IN HEFE 49
2.31 PROTEIN-EXTRAKTION AUS HEFE 49
2.32 ISOLIERUNG DER HOMOLOGEN GENE ZU
TO32 AUS J. VIRGINIANA UND C. ARIZONICA 49
2.33 KLONIERUNG DER GENE IN EXPRESSIONSVEKTOREN 50
2.33.1 KLONIERUNG FUER DIE EXPRESSION IN
E. COLI 50
2.33.2 KLONIERUNG FUER DIE EXPRESSION IN
PHYSCOMITRELLAPATENS 51
2.34 GEN-EXPRESSION IN
E. COLI 53
2.35 PROTEINEXTRAKTION UND HIS-TAG-AUFFEINIGUNG AUS
E. COLI 53
2.36 KULTUR VON
P. PATENS 54
2.37 PROTEINEXTRAKTION UND HIS-TAG-AUFREINIGUNG AUS
P. PATENS 54
2.38 PROTEINKONZENTRIERUNG 54
2.39 PROTEININTERAKTIONSSTUDIEN 56
2.39.1 PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONSSTUDIEN MIT DEM ZWEI-HYBRID-SYSTEM 56
2.39.2
IN V/TRO-INTERAKTIONSASSAY 59
2.40 CYTOKINASSAYS 61
1. ERGEBNISSE 63
3.1 PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN DER RETENTATE 128/95, 168/96 UND 461/96
63
3.2 PROTEINGEHALTE DER RETENTATE UND DEREN FAELLUNGSPRODUKTE 63
3.3 VERGLEICHENDE ANALYSE DER DREI RETENTATE 65
3.3.1 SDS-PAGE-ANALYSE DER RETENTATE 66
3.3.2 PROLIFERATIONSASSAY MIT AMMONIUMSULFATFRAKTIONEN DER RETENTATE 67
3.4 PROTEINGEHALTE DER AMMONIUMSULFATFALLUNGSPRODUKTE VON RETENTAT
461/96 71
3.5 2D-SDS-PAGE 72
3.6 GLYKOSYLIERUNG DER PROTEINE IM RETENTAT 461/96 73
3.7 DER PROTEINANTEIL VON RETENTAT 461/96 WIRKT IMMUNMODULIEREND AUF
HUMANE PBMCS 75
3.8 ANALYSE WEITERER EXTRAKTE AUS
T. OCCIDENTALIS 77
3.8.1 ANALYSE VON TPSG 77
3.8.2 EIN GLYKOPROTEINEXTRAKT AUS
T. OCCIDENTALIS WIRKT PROLIFERATIONSFOERDEMD
AUF PBMCS 79
3.9 ISOLIERUNG DER PROTEINBANDEN AUS DEM 30 KDA-CLUSTER UND
PROTEINSEQUENZIERUNG 81
3.10 ERSTELLUNG EINER CDNA-BANK AUS
T. OCCIDENTALIS 82
8
INHALTSVERZEICHNIS
3.10.1 RNA-ISOLIERUNG 82
3.10.2
T. OCCIDENTALIS CDNA-BANK 8 3
3.11 ,J*CR-SCREENING" DER
T. OCCIDENTALIS CDNA-BANK 84
3.12 YYWESTERN-BLOT" MIT ANTI-THUJA-ANTIKOERPERN 86
3.13 YYHEFE-ANTIKOERPER-SCREENING" 87
3.14 SEQUENZEN DER GENE
TO32, TO34 UND TOHL SOWIE DER PROTEINE TO32, TO34
UND TOHL 89
3.14.1 SEQUENZ VON GEN
TO32 UND STRUKTUR DES KORRESPONDIERENDEN PROTEINS 90
3.14.2 SEQUENZ VON GEN
TO34 UND STRUKTUR DES KORRESPONDIERENDEN PROTEINS 91
3.14.3 SEQUENZ VON GEN
TOHL UND STRUKTUR DES KORRESPONDIERENDEN PROTEINS 93
3.15 HOMOLOGE GENE ZU
TO32 AUS J. VIRGINIANA UND C. ARIZONICA 95
3.16 KLONIERUNG IN PET24B(+) 98
3.17 KLONIERUNG IN PRT99/35S UND TRANSFORMATION VON
P. PATENS 100
3.18 EXPRESSION VON
TOHL IN HEFE 102
3.19 EXPRESSION IN
E. COLI 102
3.20 EXPRESSION IN MOOS 108
3.21 VERGLEICH DER PROTEINE AUS PFLANZENEXTRAKTEN MIT REKOMBINANTEN
PROTEINEN 108
3.22 PROLIFERATIONSASSAYS HUMANER PBMCS MIT REKOMBINANTEN
THUJA-PROTEINEN 109
3.22.1 PROLIFERATIONSASSAY MIT TO32 110
3.22.2 PROLIFERATIONSASSAY MIT TO34 111
3.22.3 PROLIFERATIONSASSAY MIT TOHL 112
3.22.4 PROLIFERATIONSASSAY MIT VORSTIMULIERTEN HUMANEN PBMCS 113
3.22.5 CYTOKINASSAYS 114
3.23 PROTEININTERAKTIONSSTUDIEN 116
3.23.1 YYZWEI-HYBRID-SCREENING" 116
3.23.1.1 DAS PROTEIN TO32 IST TRANSAKTIVIEREND 116
3.23.1.2 DAS PROTEIN TO34 INTERAGIERT MIT HUMANEN PROTEINEN 117
3.23.1.3 DAS PROTEIN TOHL INTERAGIERT MIT HUMANEN PROTEINEN 121
3.23.1.4 INTERAKTION DER DREI
T. OCCIDENTALIS PROTEINE MIT CD4 122
3.23.1.5 ZUSAMMENFASSUNG DER ZWEI-HYBRID-STUDIEN 123
3.23.2
IN VITRO INTERAKTIONSASSAYS 124
4. DISKUSSION
127
9
INHALTSVERZEICHNIS
5. ZUSAMMENFASSUNG 143
6. LITERATURVERZEICHNIS 144
DANKSAGUNG 162
LEBENSLAUF 163 |
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