Wasserstoffmetabolismus in Cyanobakterien: molekulargenetische, biochemische und biotechnologische Analysen
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| Format: | Microfilm Book |
| Language: | German |
| Published: |
2003
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| Edition: | [Mikrofiche-Ausg.] |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 16
MATERIAL
2.1 ORGANISMEN 16
2.1.1 CYANOBAKTERIEN 16
2.1.2
ESCHERICHIA COLI 16
2.2 PLASMIDE 17
2.3 OLIGONUKLEOTIDE 19
2.4 CHEMIKALIEN 20
2.5 ENZYME 21
2.6 KITS 21
2.7 NAEHRMEDIEN 21
2.7.1 NAEHRMEDIEN FUER CYANOBAKTERIEN 21
2.7.2 NAEHRMEDIEN FUER
E. COLI 22
METHODEN
2.8 ANZUCHT 22
2.8.1 ANZUCHT DER CYANOBAKTERIEN 22
2.8.2 ANZUCHT VON
ESCHERICHIA COLI 23
2.9 KLONIERUNG 23
2.9.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E. COLI-ZELLEN 23
2.9.2 BEHANDLUNG MIT THERMOSENSITIVER ALKALISCHER PHOSPHATASE 23
2.9.3 LIGATION 24
2.9.4 TRANSFORMATION 24
2.10 DNA-ISOLIERUNG 24
2.10.1 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS CYANOBAKTERIEN 24
2.10.2 DNA-PRAEPARATION AUS MUTANTEN 24
2.10.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI DURCH ALKALISCHE LYSE 25
2.10.4 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 25
2.11 DNA-ANALYSE 25
2.11.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 25
2.11.2 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 25
2.11.3 RESTRIKTION 25
2.12 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 26
2.13 PCR-KOLONIE-SCREENING 26
2.14 PARTIELLE GENBANK 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/967971705
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.15 SOUTHEM-BLOTTING UND DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG 27
2.15.1 SOUTHERN BLOT 27
2.15.2 MARKIERUNG EINER DNA-SONDE 27
2.15.3 SOUTHEM-HYBRDISIERUNG 28
2.15.4 DETEKTION 28
2.16 SEQUENZIERUNG 29
2.17 DNA-SEQUENZALANYSE 29
2.18 RNA-PRAEPARATION 30
2.19 RNA-ANALYSE 30
2.19.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 30
2.19.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 30
2.20 NORTHEM-BLOTTING UND RNA/RNA-HYBRIDISIERUNG 30
2.20.1 HERSTELLUNG EINER RNA-SONDE DURCH
IN VITRO-TRANSKRIPTION 31
2.20.2 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION 31
2.21 RT-PCR 31
2.22 KONJUGATION VON COLI UND ANABAENA VARIABILIS ATCC 29413
ZUR HERSTELLUNG VON DELETIONSMUTANTEN 32
2.23 AEROBE INDUKTION 33
2.24 ANAEROBE INDUKTION 34
2.25 BESTIMMUNG DES CHLOROPHYLL A-GEHALTS 34
2.26 BESTIMMUNG DER NITROGENASEAKTIVITAET 34
2.27 BESTIMMUNG DER H
2
-ENTWICKLUNG 35
2.28 BESTIMMUNG DER HYDROGENASEAKTIVITAET 35
2.29 ON-LINE SYSTEM ZUR UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON LICHT UND
SAUERSTOFF AUF DIE NITROGENASEAKTIVITAET 35
2.30 SCREENING DER EXKONJUGANTEN DER TRANSPOSON-MUTAGENESE 37
2.31 HETEROLOGE EXPRESSION VON NTCA 37
2.32 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 37
2.33 COOMASSIE-FAERBUNG 38
2.34 MOBILITY-SHIFT-ASSAY 38
3 ERGEBNISSE 40
3.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER
HYPFCDEAB-GENREGION AUS
ANABAENA VARIABILIS
ATCC 29413 40
3.1.1 HERSTELLUNG EINER PARTIELLEN //MDLLL-GENBANK ZUR ISOLIERUNG DER
HYP 'DEAB
GENE 40
3.1.2 SEQUENZIERUNG DER
HYP 'DEAB-GENE UND SEQUENZANALYSE 42
3.1.3 ISOLIERUNG DER HYPFCD '-GENE MITTELS PCR 43
3.1.4 SEQUENZIERUNG DER
HYPFCD '-GENE UND DNA-SEQUENZANALYSE 45
3.2 MUTATIONSANALYSE 46
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2.1 HERSTELLUNG VON CARGOPLASMIDEN FUER DIE KONJUGATION VON
E. COLI
UND ANABAENA VARIABILIS ATCC 29413 47
3.2.2 KONJUGATION DER CARGOPLASMIDE IN DEN
ANABAENA VARIABILIS FD-STAMM 49
3.2.3 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER
HYPF-MUTANTEN S1
3.3 TRANSKRIPTIONSANALYSEN 53
3.3.1 NORTHERN BLOT-ANALYSEN VON RNA AUS NICHT STICKSTOFF FIXIERENDEN
UND STICKSTOFF FIXIERENDEN
ANABAENA-KUTIMEN 53
3.3.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR DIFFERENTIELLEN EXPRESSION DER HYP^GENE DURCH
RT-PCR 54
3.4 PROMOTORANALYSEN 56
3.4.1 AMPLIFIZIERUNG DER HUPSI-PROMOTORFFAGMENTE 56
3.4.2 HETEROLOGE EXPRESSION VON NTCA IN .
COLI 57
3.4.3 MOBILITY-SHIFT-ASSAYS 58
3.5 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER
HETRBZW. AUASL-MUTANTE VON
ANABAENA VARIABILIS
UNTER AEROBEN UND ANAEROBEN BEDINGUNGEN 60
3.5.1 DIAZOTROPHES WACHSTUM 61
3.5.2 NITROGENASEAKTIVITAET 62
3.5.3 WASSERSTOFFENTWICKLUNG 63
3.6 ON-LINE SYSTEM ZUR UNTERSUCHUNG DER EINFLUSSES VON LICHT UND
SAUERSTOFF
AUF DIE NITROGENASEAKTIVITAET 65
3.6.1 LANGZEITMESSUNGEN 65
3.6.2 RESPONSE-KURVEN 67
3.7 SCREENING VERSCHIEDENER CYANOBAKTERIEN 71
3.7.1 BESTIMMUNG DER NITROGENASEAKTIVITAET 72
3.7.2 WASSERSTOFFPRODUKTION 73
3.8 TRANSPOSON-MUTAGENESE UND SCREENING ZUR IDENTIFIZIERUNG NEUER
REGULATORISCHER GENE 75
4 DISKUSSION 77
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER AKZESSORISCHEN GENE ZUR BILDUNG EINER INTAKTEN
AUFHAHME-HYDROGENASE 77
4.2 BETEILIGUNG EINER HISTIDIN-KINASE AN DER STICKSTOFFFIXIERUNG ' 83
4.3 BETEILIGUNG DES GLOBALEN STICKSTOFFIEGULATORS NTCA AN DER EXPRESSION
DER AUP-GENE 85
4.4 EINFLUSS VON LICHT UND SAUERSTOFF AUF DIE ^-FIXIERUNG HETEROCYSTEN
BILDENDER CYANOBAKTERIEN 87
4.5 BIOTECHNOLOGISCHE ASPEKTE DER WASSERSTOFFPRODUKTION 90
5 ZUSAMMENFASSUNG 94
6 LITERATURVERZEICHNIS 96
7 ANHANG
106 |
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