G-Proteine und Melanomzellen:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Titel: G-Proteine und Melanomzellen
Autor: Bergner, Diana
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis V
Zusammenfassung VII
1 Einleitung 1
1.1 Melanozytäre Zellen 1
1.2 Heterotrimere G-Proteine 3
1.2.1 Signaltransduktionsmechanismen 4
1.2.2 Bedeutung der heterotrimeren G-Proteine 5
1.2.3 Pertussistoxin 6
1.3 Monomere G-Proteine und die Familie der Rho-Proteine 6
1.3.1 Signaltransduktionsmechanismen 7
1.3.2 Bedeutung der monomeren Rho-Proteine 10
1.3.3 Rho-Proteine modifizierende Toxine 10
1.4 Fragestellung der Arbeit 12
2 Material und Methoden 13
2.1 Chemikalien und Geräte 13
2.2 Oligonukleotide 14
2.2.1 DNA-Sequenzen aus Datenbanken 14
2.2.2 Oligonukleotide 14
2.3 Materialien für die Molekular- und Zellbiologie 15
2.3.1 Antikörper, Enzyme, Toxine, Radiochemikalien 15
2.3.2 Reagenzien und Kitsysteme 16
2.3.3 Materialien für die Zellkultur 17
2.4 Zelllinie und Zellkultur 17
2.4.1 Melanomzelllinie 17
2.4.2 Kultivierung von Melanomzellen 18
2.4.3 Bestimmung der Zellzahl 18
2.4.4 Einfrieren von Zellen 18
2.4.5 Auftauen von Zellen 19
2.5 Molekularbiologische Methoden 19
2.5.7 RNA-Isolierung 19
2.5.2 Reverse Transkription (RT) 20
2.5.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 20
II
2.6 Elektrophoretische Methoden 21
2.6.1 DNA-Agarosegelelektrophorese 21
2.6.2 Westernblot 21
2.6.2.1 Proteinisolierung, Proteinbestimmung 22
2.6.2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) 22
2.6.2.3 Elektroblotting 24
2.6.2.4 Detektion 24
2.7 Zellbiologische Methoden 25
2.7.1 ADP-Ribosylierung und Monoglucosylierung 25
2.7.2 Proliferationstests 27
2.7.2.1 MTT-Test 27
2.7.2.2 Einbau von Bromodesoxyuridin in die DNA 27
2.8 Verwendete Software und statistische Verfahren 28
3 Ergebisse 29
3.1 Heterotrimere G-Proteine 29
3.1.1 G-Protein-Subtypen 29
3.1.2 Nachweis der Pertussistoxinwirkung in Melanomzellen 30
3.2 Monomere G-Proteine 33
3.2.1 Expression von Rho-Proteinen in Melanomzellen 33
3.2.2 Nachweis der Clostridium difficile Toxin B Wirkung in
Melanomzellen 34
4 Diskussion 41
5 Schlussfolgerungen 44
Literaturverzeichnis 45
Anhang 57
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schema des G-Protein-Zyklus 5
Abbildung 2: Modell der ADP-Ribosylierung von G-Proteinen 6
Abbildung 3: Regulation des GTPase-Zyklus bei Rho-Proteinen 9
Abbildung 4: Modell der Monoglucosylierung von Rho-Proteinen 10
Abbildung 5: DNA-Agarosegelelektrophorese der Goj3 -, Goj2 -, Gai6 - PCR-
Produkte aus Melanomzellen 29
Abbildung 6: Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen die G-Protein
Subtypen Goj2, Gao, und Goc-i6 30
Abbildung 7: Autoradiogramm des Melanomzellenlysats nach ADP-
Ribosylierung durch Pertussistoxin 31
Abbildung 8: Quantifizierung des Einbaus von Radioaktivität in
Melanomzelllysat nach ADP-Ribosylierung durch Pertussistoxin
verschiedener Konzentrationen 32
Abbildung 9: Einfluß von Pertussistoxin auf die Proliferation von Melanomzellen
33
Abbildung 10: Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen die Rho-
Proteine RhoA, RhoB, RhoG, Rad, Rac2 und Cdc42 34
Abbildung 11: Autoradiogramm des Melanomzelllysats nach ADP-Ribosylierung
durch Exotoxin-C3 aus Toxin B-vorbehandelten Melanomzellen 36
Abbildung 12: Quantitative Auswertung der Autoradiogramme 37
Abbildung 13: Autoradiogramm des Melanomzelllysats der Monoglucosylierung
durch Clostridium difficile Toxin B 38
Abbildung 14: Quantitative Auswertung der Autoradiogramme 39
Abbildung 15 A/B: Konzentrations- und zeitabhängige Hemmung der
Proliferation von Hs294T-Melanomzellen durch Clostridium difficile Toxin B.
40
IV
|
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Titel: G-Proteine und Melanomzellen
Autor: Bergner, Diana
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis V
Zusammenfassung VII
1 Einleitung 1
1.1 Melanozytäre Zellen 1
1.2 Heterotrimere G-Proteine 3
1.2.1 Signaltransduktionsmechanismen 4
1.2.2 Bedeutung der heterotrimeren G-Proteine 5
1.2.3 Pertussistoxin 6
1.3 Monomere G-Proteine und die Familie der Rho-Proteine 6
1.3.1 Signaltransduktionsmechanismen 7
1.3.2 Bedeutung der monomeren Rho-Proteine 10
1.3.3 Rho-Proteine modifizierende Toxine 10
1.4 Fragestellung der Arbeit 12
2 Material und Methoden 13
2.1 Chemikalien und Geräte 13
2.2 Oligonukleotide 14
2.2.1 DNA-Sequenzen aus Datenbanken 14
2.2.2 Oligonukleotide 14
2.3 Materialien für die Molekular- und Zellbiologie 15
2.3.1 Antikörper, Enzyme, Toxine, Radiochemikalien 15
2.3.2 Reagenzien und Kitsysteme 16
2.3.3 Materialien für die Zellkultur 17
2.4 Zelllinie und Zellkultur 17
2.4.1 Melanomzelllinie 17
2.4.2 Kultivierung von Melanomzellen 18
2.4.3 Bestimmung der Zellzahl 18
2.4.4 Einfrieren von Zellen 18
2.4.5 Auftauen von Zellen 19
2.5 Molekularbiologische Methoden 19
2.5.7 RNA-Isolierung 19
2.5.2 Reverse Transkription (RT) 20
2.5.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 20
II
2.6 Elektrophoretische Methoden 21
2.6.1 DNA-Agarosegelelektrophorese 21
2.6.2 Westernblot 21
2.6.2.1 Proteinisolierung, Proteinbestimmung 22
2.6.2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) 22
2.6.2.3 Elektroblotting 24
2.6.2.4 Detektion 24
2.7 Zellbiologische Methoden 25
2.7.1 ADP-Ribosylierung und Monoglucosylierung 25
2.7.2 Proliferationstests 27
2.7.2.1 MTT-Test 27
2.7.2.2 Einbau von Bromodesoxyuridin in die DNA 27
2.8 Verwendete Software und statistische Verfahren 28
3 Ergebisse 29
3.1 Heterotrimere G-Proteine 29
3.1.1 G-Protein-Subtypen 29
3.1.2 Nachweis der Pertussistoxinwirkung in Melanomzellen 30
3.2 Monomere G-Proteine 33
3.2.1 Expression von Rho-Proteinen in Melanomzellen 33
3.2.2 Nachweis der Clostridium difficile Toxin B Wirkung in
Melanomzellen 34
4 Diskussion 41
5 Schlussfolgerungen 44
Literaturverzeichnis 45
Anhang 57
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schema des G-Protein-Zyklus 5
Abbildung 2: Modell der ADP-Ribosylierung von G-Proteinen 6
Abbildung 3: Regulation des GTPase-Zyklus bei Rho-Proteinen 9
Abbildung 4: Modell der Monoglucosylierung von Rho-Proteinen 10
Abbildung 5: DNA-Agarosegelelektrophorese der Goj3 -, Goj2 -, Gai6 - PCR-
Produkte aus Melanomzellen 29
Abbildung 6: Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen die G-Protein
Subtypen Goj2, Gao, und Goc-i6 30
Abbildung 7: Autoradiogramm des Melanomzellenlysats nach ADP-
Ribosylierung durch Pertussistoxin 31
Abbildung 8: Quantifizierung des Einbaus von Radioaktivität in
Melanomzelllysat nach ADP-Ribosylierung durch Pertussistoxin
verschiedener Konzentrationen 32
Abbildung 9: Einfluß von Pertussistoxin auf die Proliferation von Melanomzellen
33
Abbildung 10: Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen die Rho-
Proteine RhoA, RhoB, RhoG, Rad, Rac2 und Cdc42 34
Abbildung 11: Autoradiogramm des Melanomzelllysats nach ADP-Ribosylierung
durch Exotoxin-C3 aus Toxin B-vorbehandelten Melanomzellen 36
Abbildung 12: Quantitative Auswertung der Autoradiogramme 37
Abbildung 13: Autoradiogramm des Melanomzelllysats der Monoglucosylierung
durch Clostridium difficile Toxin B 38
Abbildung 14: Quantitative Auswertung der Autoradiogramme 39
Abbildung 15 A/B: Konzentrations- und zeitabhängige Hemmung der
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