Einflüsse verschiedener Stickstoffmonoxid-Donoren und des atrialen natriuretischen Peptids auf die Funktion von Melanomzellen und normalen humanen Melanozyten:
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VERWENDETE ABKÜRZUNGEN 5
I EINLEITUNG 7
11 Hautzellen 9
1.2 Malignes Melanom 10
1.3 Pathogenese der Metastasierung n
1.4 Stickstoffmonoxid 13
1.4.1 Biosynthese ^3
1.4.2 Wirkprinzipien 14
1.5 NO-Synthasen 18
1.6 NO-Donoren 20
1.7 Zyklisches 3, 5-Guanosinmonophosphat 21
1.7.1 Proteinkinasen 22
1.7.2 cGMP-gesteuerte lonenkanäle 22
1.7.3 Phosphodiesterasen 23
1.8 Guanylatzyklasen 24
1.8.1 Lösliche Guanylatzyklase 24
1.8.2 Partikuläre Guanylatzyklase 25
1.9 Natriuretische Peptide 26
1.10 Hitzestabile Enterotoxine 26
II MATERIAL UND METHODEN 28
11.1 Material 28
11.1.1 Verwendete Chemikalien 28
11.1.2 Verwendete Geräte 30
11.1.3 Verwendetes Zubehör 30
H.2 Methodik 31
11.2.1 Zellen
11.2.2 Kultivierung 32
H.2.3 Viabilitäts-Testung 35
3
11.2.4 Versuchsprotokoll zur GC-Stimulation 35
11.2.5 Extraktion Lyophilisation der Proben 37
11.2.6 Messung der cGMP-Spiegel mittels cGMP-Radioimmunoassay 38
11.2.7 Messung der cAMP-Spiegel mittels cAMP-Fluoreszenzimmunoassay 40
11.2.8 Proteinbestimmung nach Lowry 41
11.2.9 Berechnung des absoluten cGMP- bzw. cAMP-Gehaltes einer Probe 42
11.2.10 Ermittlung der Wachstumskinetik unter Stimulation der Guanylatzyklasen 43
11.2.11 Statistik 44
III ERGEBNISSE 45
111.1 Zellmorphologie unter basalen Wachstumsbedingungen 45
111.2 Zellmorphologie unter Stimulationsbedingungen 46
IM.3 Vitaiitatsbeurteiiung im Langzeitversuch 46
111.4 Wachstumskinetik unter Stimulationsbedingungen 48
Ml.4.1 Einfluss von SIN-1 48
Hl.4.2 Einfluss von ANP 51
111.5 cGMP-Spiegel unter Stimulationsbedingungen 55
111.5.1 cGMP-Spiegel unter Stimulation der sGC 55
111.5.2 cGMP-Spiegel unter Stimulation der GC-A 57
111.5.3 cGMP-Spiegel unter Stimulation der GC-C 58
111.6 cAMP-Spiegel unter Stimulation der sGC 59
IV DISKUSSION 60
IV.1 cGMP-Spiegel unter Stimulationbedingungen 60
IV. 1.1 Effekte der sGC-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 60
IV.1.2 Effekte der GC-A-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 63
IV.1.3 Effekte der GC-C-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 64
IV.2 Proliferation in Abhängigkeit der Stimulationswege 65
IV.2.1 Wachstumskinetik nach Stimulation mittels SIN-1 als NO-Donor 65
IV.2.2 Wachstumskinetik nach Stimulation mittels natnuretischem Peptid 66
IV.3 cAMP-Spiegel unter Stimulationbedingungen 67
rv.4 Tumorzellverhatten in Abhängigkeit der NO-Spiegel und (Möglichkeiten der Intervention 68
4
IV.5 Schlussfolgerung 70
V ZUSAMMENFASSUNG 72
VI LITERATUR 74
VII DANKSAGUNG 84
VIII LEBENSLAUF 85
|
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2
VERWENDETE ABKÜRZUNGEN 5
I EINLEITUNG 7
11 Hautzellen 9
1.2 Malignes Melanom 10
1.3 Pathogenese der Metastasierung n
1.4 Stickstoffmonoxid 13
1.4.1 Biosynthese ^3
1.4.2 Wirkprinzipien 14
1.5 NO-Synthasen 18
1.6 NO-Donoren 20
1.7 Zyklisches 3, 5-Guanosinmonophosphat 21
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1.8 Guanylatzyklasen 24
1.8.1 Lösliche Guanylatzyklase 24
1.8.2 Partikuläre Guanylatzyklase 25
1.9 Natriuretische Peptide 26
1.10 Hitzestabile Enterotoxine 26
II MATERIAL UND METHODEN 28
11.1 Material 28
11.1.1 Verwendete Chemikalien 28
11.1.2 Verwendete Geräte 30
11.1.3 Verwendetes Zubehör 30
H.2 Methodik 31
11.2.1 Zellen
11.2.2 Kultivierung 32
H.2.3 Viabilitäts-Testung 35
3
11.2.4 Versuchsprotokoll zur GC-Stimulation 35
11.2.5 Extraktion Lyophilisation der Proben 37
11.2.6 Messung der cGMP-Spiegel mittels cGMP-Radioimmunoassay 38
11.2.7 Messung der cAMP-Spiegel mittels cAMP-Fluoreszenzimmunoassay 40
11.2.8 Proteinbestimmung nach Lowry 41
11.2.9 Berechnung des absoluten cGMP- bzw. cAMP-Gehaltes einer Probe 42
11.2.10 Ermittlung der Wachstumskinetik unter Stimulation der Guanylatzyklasen 43
11.2.11 Statistik 44
III ERGEBNISSE 45
111.1 Zellmorphologie unter basalen Wachstumsbedingungen 45
111.2 Zellmorphologie unter Stimulationsbedingungen 46
IM.3 Vitaiitatsbeurteiiung im Langzeitversuch 46
111.4 Wachstumskinetik unter Stimulationsbedingungen 48
Ml.4.1 Einfluss von SIN-1 48
Hl.4.2 Einfluss von ANP 51
111.5 cGMP-Spiegel unter Stimulationsbedingungen 55
111.5.1 cGMP-Spiegel unter Stimulation der sGC 55
111.5.2 cGMP-Spiegel unter Stimulation der GC-A 57
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IV DISKUSSION 60
IV.1 cGMP-Spiegel unter Stimulationbedingungen 60
IV. 1.1 Effekte der sGC-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 60
IV.1.2 Effekte der GC-A-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 63
IV.1.3 Effekte der GC-C-Stimulation auf die intrazellulären cGMP-Spiegel 64
IV.2 Proliferation in Abhängigkeit der Stimulationswege 65
IV.2.1 Wachstumskinetik nach Stimulation mittels SIN-1 als NO-Donor 65
IV.2.2 Wachstumskinetik nach Stimulation mittels natnuretischem Peptid 66
IV.3 cAMP-Spiegel unter Stimulationbedingungen 67
rv.4 Tumorzellverhatten in Abhängigkeit der NO-Spiegel und (Möglichkeiten der Intervention 68
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IV.5 Schlussfolgerung 70
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