Funktionelle Charakterisierung der Glucosetransporter GLUT6 und GLUT11:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Struktur der GLUT Proteine 2
1.2. Die GLUT Familie 4
1.3. GLUT6 und GLUT11 im Kontext der GLUT Familie 10
1.4. Zielsetzung der Arbeit 11
1.4.1. Hinweise für die Existenz weiterer Glucosetransporter 11
1.4.2. Datenbanksuche und Klonierung von potenziellen GLUT Isoformen 12
1.4.3. Vorgehensweise 12
2. Material und Methoden 13
2.1. Materialien und Geräte 13
2.1.1. Chemikalien 13
2.1.2. Zentrifugen und Rotoren 14
2.1.3. Geräte 14
2.1.4. Radioaktivität 15
2.1.5. Zellkultur 15
2.1.6. Sonstiges 16
2.2. Molekularbiologisches Material 16
2.2.1. Bakterienstamm E. coli DH5ct 16
2.2.2. Expressionsvektor pCMV 16
2.3. Molekularbiologische Grundtechniken 17
2.3.1. Minipräparation von Plasmiden 17
2.3.2. Maxipräparation von Plasmiden 17
2.3.3. Restriktionsverdaue 18
2.3.4. Agarosegelelektrophorese 18
2.3.5. Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 19
2.3.6. Umklonierung von GLUT6 in den Expressionsvektor pCMV 19
2.3.7. DNA Sequenzierung 19
2.4. Mikrobiologische Methoden 20
2.4.1. Transformation von E. co/; Zellen durch Hitzeschock 20
2.4.2. Transformation von E. co// Zellen durch Elektroporation 20
Inhaltsverzeichnis
2.5. Zellbiologische Methoden 20
2.5.1. Zellen 20
2.5.2. Kulturbedingungen und Medien 21
2.5.3. Subkultivierung 21
2.5.4. Transiente Transfektion von COS 7 Zellen 21
2.5.4.1. Transiente Transfektion mit FuGENE 21
2.5.4.2. Transiente Transfektion mit Calciumphosphat 22
2.6. Biochemische Methoden 22
2.6.1. Photometrische Proteinbestimmung 22
2.6.2. Fraktionierung von COS 7 Zellen 23
2.6.3. SDS Polyacrylamidgelelektrophorese(SDS PAGE) 24
2.6.4. Westernblot 26
2.6.5. Immunchemische Detektion von Proteinen 27
2.6.5.1. Immunoassay mit 5I ProteinA 27
2.6.5.2. Chemilumineszenzentwicklung(ECL System) 27
2.6.6. Bestimmung der Bindungsaffinität von [4 3H]Cytochalasin B 28
2.6.7. Rekonstitution der Glucosetransportaktivität 29
2.6.8. D Glucoseaufhahme in rekonstituierte Membranvesikel 30
2.6.9. Ascorbinsäureaufnahme in rekonstituierte Membranvesikel 31
2.6.10. Ascorbinsäureaufhahme in COS 7 Zellen 32
3. Ergebnisse 35
3.1. Der Zuckertransporter GLUT6 35
3.1.1. Sequenzielle Homologien des GLUT6 35
3.1.2. Immunchemische Detektion von GLUT6 38
3.1.3. Bestimmung der Bindungsaffinität von Cytochalasin B an GLUT6 39
3.1.4. Bestimmung der rekonstituierten Glucosetransportaktivität von GLUT6 40
3.1.5. Bestimmung der rekonstituierten Ascorbinsäuretransportaktivität von GLUT6 42
3.1.6. Bestimmung der Ascorbinsäuretransportaktivität von GLUT6 an intakten Zellen 43
3.2. Der Zuckertransporter GLUT 11 44
3.2.1. Immunchemische Detektion von GLUT11 44
3.2.2. Bestimmung der Bindungsaffinität von Cytochalasin B an GLUT11 45
3.2.3. Bestimmung der rekonstituierten Glucosetransportaktivität von GLUT11 46
Inhaltsverzeichnis
4. Diskussion 49
4.1. GLUT6 ein niedrigaffiner Glucosetransporter 49
4.2. Verwandtschaftsverhältnisse des GLUT6 und GLUT8 53
4.3. GLUT11 ein potenzieller Fructosetransporter mit niedriger Affinität zu D Glucose 57
4.4. Warum gibt es so viele GLUTs ? 59
5. Zusammenfassung 61
6. Anhang 63
6.1. Abkürzungsverzeichnis 63
6.2. Abbildungsverzeichnis 64
6.3. „Ein Buchstaben Aminosäure CWe 65
7. Literaturverzeichnis 67
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Struktur der GLUT Proteine 2
1.2. Die GLUT Familie 4
1.3. GLUT6 und GLUT11 im Kontext der GLUT Familie 10
1.4. Zielsetzung der Arbeit 11
1.4.1. Hinweise für die Existenz weiterer Glucosetransporter 11
1.4.2. Datenbanksuche und Klonierung von potenziellen GLUT Isoformen 12
1.4.3. Vorgehensweise 12
2. Material und Methoden 13
2.1. Materialien und Geräte 13
2.1.1. Chemikalien 13
2.1.2. Zentrifugen und Rotoren 14
2.1.3. Geräte 14
2.1.4. Radioaktivität 15
2.1.5. Zellkultur 15
2.1.6. Sonstiges 16
2.2. Molekularbiologisches Material 16
2.2.1. Bakterienstamm E. coli DH5ct 16
2.2.2. Expressionsvektor pCMV 16
2.3. Molekularbiologische Grundtechniken 17
2.3.1. Minipräparation von Plasmiden 17
2.3.2. Maxipräparation von Plasmiden 17
2.3.3. Restriktionsverdaue 18
2.3.4. Agarosegelelektrophorese 18
2.3.5. Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 19
2.3.6. Umklonierung von GLUT6 in den Expressionsvektor pCMV 19
2.3.7. DNA Sequenzierung 19
2.4. Mikrobiologische Methoden 20
2.4.1. Transformation von E. co/;' Zellen durch Hitzeschock 20
2.4.2. Transformation von E. co// Zellen durch Elektroporation 20
Inhaltsverzeichnis
2.5. Zellbiologische Methoden 20
2.5.1. Zellen 20
2.5.2. Kulturbedingungen und Medien 21
2.5.3. Subkultivierung 21
2.5.4. Transiente Transfektion von COS 7 Zellen 21
2.5.4.1. Transiente Transfektion mit FuGENE 21
2.5.4.2. Transiente Transfektion mit Calciumphosphat 22
2.6. Biochemische Methoden 22
2.6.1. Photometrische Proteinbestimmung 22
2.6.2. Fraktionierung von COS 7 Zellen 23
2.6.3. SDS Polyacrylamidgelelektrophorese(SDS PAGE) 24
2.6.4. Westernblot 26
2.6.5. Immunchemische Detektion von Proteinen 27
2.6.5.1. Immunoassay mit' 5I ProteinA 27
2.6.5.2. Chemilumineszenzentwicklung(ECL System) 27
2.6.6. Bestimmung der Bindungsaffinität von [4 3H]Cytochalasin B 28
2.6.7. Rekonstitution der Glucosetransportaktivität 29
2.6.8. D Glucoseaufhahme in rekonstituierte Membranvesikel 30
2.6.9. Ascorbinsäureaufnahme in rekonstituierte Membranvesikel 31
2.6.10. Ascorbinsäureaufhahme in COS 7 Zellen 32
3. Ergebnisse 35
3.1. Der Zuckertransporter GLUT6 35
3.1.1. Sequenzielle Homologien des GLUT6 35
3.1.2. Immunchemische Detektion von GLUT6 38
3.1.3. Bestimmung der Bindungsaffinität von Cytochalasin B an GLUT6 39
3.1.4. Bestimmung der rekonstituierten Glucosetransportaktivität von GLUT6 40
3.1.5. Bestimmung der rekonstituierten Ascorbinsäuretransportaktivität von GLUT6 42
3.1.6. Bestimmung der Ascorbinsäuretransportaktivität von GLUT6 an intakten Zellen 43
3.2. Der Zuckertransporter GLUT 11 44
3.2.1. Immunchemische Detektion von GLUT11 44
3.2.2. Bestimmung der Bindungsaffinität von Cytochalasin B an GLUT11 45
3.2.3. Bestimmung der rekonstituierten Glucosetransportaktivität von GLUT11 46
Inhaltsverzeichnis
4. Diskussion 49
4.1. GLUT6 ein niedrigaffiner Glucosetransporter 49
4.2. Verwandtschaftsverhältnisse des GLUT6 und GLUT8 53
4.3. GLUT11 ein potenzieller Fructosetransporter mit niedriger Affinität zu D Glucose 57
4.4. Warum gibt es so viele GLUTs ? 59
5. Zusammenfassung 61
6. Anhang 63
6.1. Abkürzungsverzeichnis 63
6.2. Abbildungsverzeichnis 64
6.3. „Ein Buchstaben" Aminosäure CWe 65
7. Literaturverzeichnis 67 |
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