Molekulare Pathogenese der Nephronophthise: Identifikation neuer Nephrocystin-interagierender Proteine
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Inhaltsverzeichnis
Seite
I.Einleitung 5
1.1 Einführung in das Krankheitsbild der juvenilen Nephronophthise 5
1.2 Molekularbiologie und Proteinbiochemie der juvenilen Nephronophthise 6
1.2.1 Genetik 6
1.2.2 Molekulare Struktur des Nephrocystins 7
1.2.3 Bindungspartner und Funktion des Nephrocystins 8
1.2.4 Von Hippel Lindau Syndrom und Zystennieren 10
1.3 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit 11
2. Methoden 11
2.1 Materialien und Lösungen 11
2.1.1 Zellkultur 11
2.1.2 Transfektion 12
2.1.3 Detergentien und Puffer 12
2.1.4 Materialien für SDS Gelelektrophorese und Immunoblot 13
2.1.5 Materialien für Coomassie 14
2.1.6 Materialien für Silberfärbung 15
2.1.7 Immunpräzipitation 15
2.1.8 Immunfluoreszenz 15
2.1.9 Antikörper 15
2.2 Zellkultur 16
2.3 Transfektion 17
2.4 Ernten von HEK 293T Zellen im Experiment 18
2.5 DNA, Plasmide und Generierung von Proteinfragmenten (Trunkationen) 18
2.6 Immunpräzipitation 19
2.6.1 Immunpräzipitation 19
2.6.2 Präparative Koimmunpräzipitation für zweidimensionale Gelelektrophorese 19
2.6.3 Endogene Koimmunpräzipitation aus Mäusegewebe 20
2.7 SDS Gelelektrophorese und Immunoblot 20
2.7.1 eindimensionale Gelelektrophorese 20
2.7.2 zweidimensionale Gelelektrophorese 22
2.8 Proteindetektion 23
2.8.1 Proteinfärbung mit Coomassie Blau 23
2.8.2 Silberfärbung . 24
2.9 Massenspektrometrie 24
2.10 Immunfluoreszenz 24
3. Ergebnisse 26
3.1 Interaktion des Nephrocystins mit dem Von Hippel Lindau Protein 26
3.2 Interaktion des Nephrocystins mit Beta Tubulin 29
3.3 Kolokalisation von pVHL, NPHP1 und Beta Tubulin im Zilium von MDCK Zellen 32
4. Diskussion 35
5. Zusammenfassung 39
6. Literatur 40
7. Anhang 45
7.1 Abkürzungen 45
7.2 Danksagungen 47
7.3 Lebenslauf 48
|
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4
Inhaltsverzeichnis
Seite
I.Einleitung 5
1.1 Einführung in das Krankheitsbild der juvenilen Nephronophthise 5
1.2 Molekularbiologie und Proteinbiochemie der juvenilen Nephronophthise 6
1.2.1 Genetik 6
1.2.2 Molekulare Struktur des Nephrocystins 7
1.2.3 Bindungspartner und Funktion des Nephrocystins 8
1.2.4 Von Hippel Lindau Syndrom und Zystennieren 10
1.3 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit 11
2. Methoden 11
2.1 Materialien und Lösungen 11
2.1.1 Zellkultur 11
2.1.2 Transfektion 12
2.1.3 Detergentien und Puffer 12
2.1.4 Materialien für SDS Gelelektrophorese und Immunoblot 13
2.1.5 Materialien für Coomassie 14
2.1.6 Materialien für Silberfärbung 15
2.1.7 Immunpräzipitation 15
2.1.8 Immunfluoreszenz 15
2.1.9 Antikörper 15
2.2 Zellkultur 16
2.3 Transfektion 17
2.4 Ernten von HEK 293T Zellen im Experiment 18
2.5 DNA, Plasmide und Generierung von Proteinfragmenten (Trunkationen) 18
2.6 Immunpräzipitation 19
2.6.1 Immunpräzipitation 19
2.6.2 Präparative Koimmunpräzipitation für zweidimensionale Gelelektrophorese 19
2.6.3 Endogene Koimmunpräzipitation aus Mäusegewebe 20
2.7 SDS Gelelektrophorese und Immunoblot 20
2.7.1 eindimensionale Gelelektrophorese 20
2.7.2 zweidimensionale Gelelektrophorese 22
2.8 Proteindetektion 23
2.8.1 Proteinfärbung mit Coomassie Blau 23
2.8.2 Silberfärbung '. 24
2.9 Massenspektrometrie 24
2.10 Immunfluoreszenz 24
3. Ergebnisse 26
3.1 Interaktion des Nephrocystins mit dem Von Hippel Lindau Protein 26
3.2 Interaktion des Nephrocystins mit Beta Tubulin 29
3.3 Kolokalisation von pVHL, NPHP1 und Beta Tubulin im Zilium von MDCK Zellen 32
4. Diskussion 35
5. Zusammenfassung 39
6. Literatur 40
7. Anhang 45
7.1 Abkürzungen 45
7.2 Danksagungen 47
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