Charakterisierung dendritischer Zellen zur Lipofektion mit neuen Transfektionsreagenzien:
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2004
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| adam_text | Titel: Charakterisierung dendritischer Zellen zur Lipofektion mit neuen Transfektionsreagenzien
Autor: Chang, De Min Vroni
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN UND AKRONYME I
INHALTSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 Tumorerkrankungen 1
1.2 Prinzipien der Gen- und Immuntherapie 1
1.3 Voraussetzungen zur Induktion einer Immunantwort 2
1.4 Dendritische Zellen und deren Bedeutung für die Immunantwort 5
1.5 Lebenszyklus der DCs 7
1.6 Tumorimmunologie-Rolle der DCs 9
1.7 tumorvakzinierung mit dcs 12
1.8 Gentransfer-Methoden 15
1.9 Lipofektion 16
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung 18
2 MATERIAL UND GERÄTE 19
2.1 Biologisches Material 19
2.2 Puffer und Medien 19
2.3 Zytokine 20
2.4 Antikörper 21
2.5 Lipide 22
2.6 Weitere Substanzen 23
2.7 Verbrauchsmaterial 24
2.8 Geräte 24
3 METHODEN 26
3.1 Zellkultur 26
3.1.1 Dendritische Zellen 26
iv
Inhaltsverzeichnis
3.1.2 COS-7 Zellen 28
3.1.3 Einfrieren und auftauen von Zellkulturen 28
3.2 durchflusszytometrische untersuchung der oßerflächenantigene von dcs
29
3.3 Transfektionsversuche mit Hilfe des Pipettierroboters 30
3.3.1 Vorbereitung der Zellen 30
3.3.2 LlPOSOMENBILDUNG 30
3.3.3 llpoplexbildung und transfektion 30
3.3.4 posttransfektionsassays 32
3.4 durchflusszytometrische untersuchungen zur bindung und internalisation
von llpoplexen in cos-zellen und in dcs 34
3.4.1 Herstellung der Lipoplexe 34
3.4.2 Vorbereitung der Zellen 35
3.4.3 Transfektionsbedingungen 35
3.4.4 Durchflusszytometrische Untersuchung 35
4 ERGEBNISSE 37
4.1 Durchflusszytometrische Untersuchungen 37
4.1.1 Durchflusszytometrische Untersuchung der Oberflächenantigene der DCs
bzw. monozyten 37
4.1.2 Durchflusszytometrische Untersuchung der reifen DCs 38
4.1.3 Kultur dendritischer Zellen im serumfreien Medium 42
4.1.4 Kultur dendritischer Zellen nach Veränderung des Zytokinmilieus 43
4.1.5 Einfrieren dendritischer Zellen und ihrer Vorläuferzellen 47
4.2 LlPOFEKTION 47
4.3 Untersuchungen zum Mechanismus der Lipofektion 49
4.3.1 Internalisation der Lipoplexe in Abhängigkeit von der Bindung 49
4.3.2 Transfektionseffizienz in Abhängigkeit von der Internalisation der Lipoplexe
52
5 DISKUSSION 53
5.1 Charakterisierung dendritischer Zellen 53
V
Inhaltsverzeichnis
5.1.1 Gewinnung dendritischer Zellen 53
5.1.2 Oberflächenmarker dendritischer Zellen 54
5.1.3 Dendritische Zellen aus serumfreier Kultur 56
5.1.4 Dendritische Zellen nach Veränderung der Zytokinmilieus 57
5.1.5 Einfrieren dendritischer Zellen 59
5.2 Transfektion dendritischer Zellen 59
5.2.1 Verbesserung der Lipofektion dendritischer Zellen 60
5.2.2 Untersuchungen zu Einzelschritten der Lipofektion 62
5.2.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 64
6 ZUSAMMENFASSUNG 66
7 LITERATURVERZEICHNIS 67
CURRICULUM VITAE 78
vi
|
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Titel: Charakterisierung dendritischer Zellen zur Lipofektion mit neuen Transfektionsreagenzien
Autor: Chang, De Min Vroni
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN UND AKRONYME I
INHALTSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 Tumorerkrankungen 1
1.2 Prinzipien der Gen- und Immuntherapie 1
1.3 Voraussetzungen zur Induktion einer Immunantwort 2
1.4 Dendritische Zellen und deren Bedeutung für die Immunantwort 5
1.5 Lebenszyklus der DCs 7
1.6 Tumorimmunologie-Rolle der DCs 9
1.7 tumorvakzinierung mit dcs 12
1.8 Gentransfer-Methoden 15
1.9 Lipofektion 16
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung 18
2 MATERIAL UND GERÄTE 19
2.1 Biologisches Material 19
2.2 Puffer und Medien 19
2.3 Zytokine 20
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2.5 Lipide 22
2.6 Weitere Substanzen 23
2.7 Verbrauchsmaterial 24
2.8 Geräte 24
3 METHODEN 26
3.1 Zellkultur 26
3.1.1 Dendritische Zellen 26
iv
Inhaltsverzeichnis
3.1.2 COS-7 Zellen 28
3.1.3 Einfrieren und auftauen von Zellkulturen 28
3.2 durchflusszytometrische untersuchung der oßerflächenantigene von dcs
29
3.3 Transfektionsversuche mit Hilfe des Pipettierroboters 30
3.3.1 Vorbereitung der Zellen 30
3.3.2 LlPOSOMENBILDUNG 30
3.3.3 llpoplexbildung und transfektion 30
3.3.4 posttransfektionsassays 32
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3.4.1 Herstellung der Lipoplexe 34
3.4.2 Vorbereitung der Zellen 35
3.4.3 Transfektionsbedingungen 35
3.4.4 Durchflusszytometrische Untersuchung 35
4 ERGEBNISSE 37
4.1 Durchflusszytometrische Untersuchungen 37
4.1.1 Durchflusszytometrische Untersuchung der Oberflächenantigene der DCs
bzw. monozyten 37
4.1.2 Durchflusszytometrische Untersuchung der reifen DCs 38
4.1.3 Kultur dendritischer Zellen im serumfreien Medium 42
4.1.4 Kultur dendritischer Zellen nach Veränderung des Zytokinmilieus 43
4.1.5 Einfrieren dendritischer Zellen und ihrer Vorläuferzellen 47
4.2 LlPOFEKTION 47
4.3 Untersuchungen zum Mechanismus der Lipofektion 49
4.3.1 Internalisation der Lipoplexe in Abhängigkeit von der Bindung 49
4.3.2 Transfektionseffizienz in Abhängigkeit von der Internalisation der Lipoplexe
52
5 DISKUSSION 53
5.1 Charakterisierung dendritischer Zellen 53
V
Inhaltsverzeichnis
5.1.1 Gewinnung dendritischer Zellen 53
5.1.2 Oberflächenmarker dendritischer Zellen 54
5.1.3 Dendritische Zellen aus serumfreier Kultur 56
5.1.4 Dendritische Zellen nach Veränderung der Zytokinmilieus 57
5.1.5 Einfrieren dendritischer Zellen 59
5.2 Transfektion dendritischer Zellen 59
5.2.1 Verbesserung der Lipofektion dendritischer Zellen 60
5.2.2 Untersuchungen zu Einzelschritten der Lipofektion 62
5.2.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 64
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