Generierung und Charakterisierung rekombinanter Immunrezeptoren gegen das Melanom:
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2005
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 MALIGNES MELANOM 1
1.2 TUMORASSOZIIERTE ANTIGENE (TAA) 2
1.3 IMMUNTHERAPIE VON MALIGNEN TUMOREN 4
1.3.1 Antikörper gestützte Immuntherapien 4
1.3.2 Adoptive zelluläre Immuntherapie 5
1.3.3 Kombination von zellulärer und Antikörper vermittelter Immuntherapie 6
1.4 DIE IMMUNREZEPTOR STRATEGIE MIT HILFE REKOMBINANTER T ZELL REZEPTOREN 7
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 10
2 MATERIAL 12
2.1 STAMMLOSUNGEN UND PUFFER 12
2.2 LOSUNGEN UND PUFFER FÜR DIE GELELEKTROPHORESE 12
2.3 GRÖßENMARKER FÜR DIE GELELEKTROPHORESE 13
2.3.1 DNS Größenmarker 13
2.3.2 Protein Molekulargewichtsmarker 13
2.4 LOSUNGEN UND PUFFER FÜR DEN WESTERN BLOT 14
2.5 MEDIEN FÜR DIE BAKTERIENKULTUR UND MEDIENZUSÄTZE 14
2.6 BAKTERIENSTÄMME 15
2.7 ZELLEN UNDZELLINIEN 15
2.8 MEDIEN FÜR DIE ZELLKULTUR UND MEDIENZUSÄTZE 17
2.9 ANTIKÖRPER UND ANTISEREN 18
2.9.1 Primärantikörper 18
2.9.2 Konjugierte Sekundärantikörper 19
2.10 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN UND RESTRIKTIONSPUFFER 20
2.11 OLIGONUKLEOTIDE 20
2.12 VEKTOREN 21
3 METHODEN 23
3.1 PRÄPARATION VON PLASMID DNS 23
3.1.1 Midi Präparation von Plasmid DNS durch Bindung an eine Anionenaustauschersäule 23
3.1.2 Schnellpräparation von Plasmid DNS nach der Koch (boiling) Methode 23
3.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSÄUREN 24
3.2.1 Photometrische Bestimmung 24
3.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel gegen Markerbanden 24
3.3 GELELEKTROPHORESE 25
3.3.1 Native Agarose Gelelektrophorese 25
3.3.2 Denaturierende SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese 25
3.4 WESTERN BLOT ZUR MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 26
3.5 ISOLIERUNG VON DNS FRAGMENTEN AUS AGAROSE DURCH BINDUNG AN SILIZIUMPARTIKEI 26
3.6 ENZYMATISCHE REAKTIONEN MIT DNS 27
3.6.1 Verdau von DNS Doppelsträngen durch Restriktionsendonukleasen 27
3.6.2 Ligation von DNS Doppelsträngen durch T4 DNS Ligase 27
3.6.3 Ligation von DNS Doppelsträngen mittels TA Cloning® Kit 27
3.7 BAKTERIENKULTUR 28
3.7.1 Herstellung kompetenter E.coli DH5a Bakterien 28
3.7.2 Transformation kompetenter E.coli DH5ct Bakterien 28
3.7.3 Transformation kompetenter Bakterien mittels TA Cloning® Kit 29
3.8 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 29
3.9 PLASMID SEQUENZIERUNG NACH DER KETTENABBRUCH METHODE 30
3.10 ZELLKULTUR 3.10.1 Trypsinierung und Resuspendierung adhärenter Zellen 31
3.10.2 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentifugation 31
3.10.3 Kultivierung humaner peripherer Blut Lymphozyten zur Gewinnung vorstimulierter 32
Lymphozyten 3.10.4 Calcium PhosphatTransfektion 32
3.10.5 FuGENE Transfektion 32
3.10.6 Herstellung von Zell Lysat 3.10.7 Transduktion von peripheren Blutlymphozyten 33
3.10.8 Stimulation von transduzierten Lymphozyten durch Kokultivierung ...I... 34
3.11 FUNKTIONS ANALYSEN 3.11.1 Enzym gekoppelte Immunoadsorbanztests (ELISA) 34
3.11.2 Zytokin ELISA zur Bestimmung von IFNy 35
3.11.3 Immunfluoreszenz (FACS) Analysen 35
3.11.4 Zylotoxizitätstest
36
4 ERGEBNISSE ^1 f!^
4.1.2 Genenerung des rekombinanten Rezeptors L49scFv Fc Y (#578) 39
4.1.3 Genenerung des rekombinan.en Rezeptors L49scFv Fc C (#579) 41
4 2 EXPRESSEN DES FUS,ONSPROTE,NS L49SCFV FC «54)
« NACHWE,S DER EXPRESSE VON MELANOTRANSFERRlN .P^AUFTUMORZELLEN 4.4 B,NDUNG DES FUS,ONSPROTE,NS AN MELANOTRANSFERR.N 442 rn9 r FUSionsproleins L49scFv Fc (#554) an ^—«,::::: 49
4 5 EXPR^l o I iOnSPrO einS W9SCFV FC #554) a im— Melanotransfernn 51
10 EXPRESSION UND NACHWEIS DER REZEPTOREN
4.5.1 Expression der rekombinanten Rezeptoren #578 und #579^3^ 53
4.5, N sderrekombinan,enRezep,orenim2e,,ysatfransfaierter293T.Zete ;:
4.5.3 Bindung der rekombinanten Rezeptoren #578 und #579 an indirekt immobilisiertes 55
Melanotransferrin (p97) 55
4.6 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER REZEPTORPROTEINE #578 UND #579 58
4.7 EXPRESSION DER REKOMBINANTEN REZEPTOREN AUF DER OBERFLACHE VON LYMPHOZYTEN ... 59
4.8 FUNKTIONSANALYSEN DER REZEPTOREN 61
4.8.1 Aktivierung von transduzierten Lymphozyten mit immobilisiertem Antikörper 61
4.8.2 Rezeptor vermittelte Aktivierung von transduzierten Lymphozyten nach Koinkubation 63
mitAntigen positiven Tumorzellen 63
4.9 ZYTOLYSE VON MELANOTRANSFERRIN POSITIVEN TUMORZELLEN DURCH KOKULTIVIERUNG 65
MIT REZEPTOR EXPRIMIERENDEN LYMPHOZYTEN 65
5 DISKUSSION 68
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VORABVERÖFFENTLICHUNG 85
9 ANHANG 86
9.1 NUKLEOTIDSEQUENZ DES FUSIONSPROTEINS L49SCFV FC 86
9.2 NUKLEOTIDSEQUENZ DES REKOMBINANTEN REZEPTORS L49SCFV FC G 89
9.3 NUKLEOTIDSEQUENZ DES REKOMBINANTEN REZEPTORS U9SCFV FC Z 92
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 MALIGNES MELANOM 1
1.2 TUMORASSOZIIERTE ANTIGENE (TAA) 2
1.3 IMMUNTHERAPIE VON MALIGNEN TUMOREN 4
1.3.1 Antikörper gestützte Immuntherapien 4
1.3.2 Adoptive zelluläre Immuntherapie 5
1.3.3 Kombination von zellulärer und Antikörper vermittelter Immuntherapie 6
1.4 DIE IMMUNREZEPTOR STRATEGIE MIT HILFE REKOMBINANTER T ZELL REZEPTOREN 7
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 10
2 MATERIAL 12
2.1 STAMMLOSUNGEN UND PUFFER 12
2.2 LOSUNGEN UND PUFFER FÜR DIE GELELEKTROPHORESE 12
2.3 GRÖßENMARKER FÜR DIE GELELEKTROPHORESE 13
2.3.1 DNS Größenmarker 13
2.3.2 Protein Molekulargewichtsmarker 13
2.4 LOSUNGEN UND PUFFER FÜR DEN WESTERN BLOT 14
2.5 MEDIEN FÜR DIE BAKTERIENKULTUR UND MEDIENZUSÄTZE 14
2.6 BAKTERIENSTÄMME 15
2.7 ZELLEN UNDZELLINIEN 15
2.8 MEDIEN FÜR DIE ZELLKULTUR UND MEDIENZUSÄTZE 17
2.9 ANTIKÖRPER UND ANTISEREN 18
2.9.1 Primärantikörper 18
2.9.2 Konjugierte Sekundärantikörper 19
2.10 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN UND RESTRIKTIONSPUFFER 20
2.11 OLIGONUKLEOTIDE 20
2.12 VEKTOREN 21
3 METHODEN 23
3.1 PRÄPARATION VON PLASMID DNS 23
3.1.1 Midi Präparation von Plasmid DNS durch Bindung an eine Anionenaustauschersäule 23
3.1.2 Schnellpräparation von Plasmid DNS nach der Koch (boiling) Methode 23
3.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSÄUREN 24
3.2.1 Photometrische Bestimmung 24
3.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel gegen Markerbanden 24
3.3 GELELEKTROPHORESE 25
3.3.1 Native Agarose Gelelektrophorese 25
3.3.2 Denaturierende SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese 25
3.4 WESTERN BLOT ZUR MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 26
3.5 ISOLIERUNG VON DNS FRAGMENTEN AUS AGAROSE DURCH BINDUNG AN SILIZIUMPARTIKEI 26
3.6 ENZYMATISCHE REAKTIONEN MIT DNS 27
3.6.1 Verdau von DNS Doppelsträngen durch Restriktionsendonukleasen 27
3.6.2 Ligation von DNS Doppelsträngen durch T4 DNS Ligase 27
3.6.3 Ligation von DNS Doppelsträngen mittels TA Cloning® Kit 27
3.7 BAKTERIENKULTUR 28
3.7.1 Herstellung kompetenter E.coli DH5a Bakterien 28
3.7.2 Transformation kompetenter E.coli DH5ct Bakterien 28
3.7.3 Transformation kompetenter Bakterien mittels TA Cloning® Kit 29
3.8 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 29
3.9 PLASMID SEQUENZIERUNG NACH DER KETTENABBRUCH METHODE 30
3.10 ZELLKULTUR 3.10.1 Trypsinierung und Resuspendierung adhärenter Zellen 31
3.10.2 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentifugation 31
3.10.3 Kultivierung humaner peripherer Blut Lymphozyten zur Gewinnung vorstimulierter 32
Lymphozyten 3.10.4 Calcium PhosphatTransfektion 32
3.10.5 FuGENE Transfektion 32
3.10.6 Herstellung von Zell Lysat 3.10.7 Transduktion von peripheren Blutlymphozyten 33
3.10.8 Stimulation von transduzierten Lymphozyten durch Kokultivierung .I. 34
3.11 FUNKTIONS ANALYSEN 3.11.1 Enzym gekoppelte Immunoadsorbanztests (ELISA) 34
3.11.2 Zytokin ELISA zur Bestimmung von IFNy 35
3.11.3 Immunfluoreszenz (FACS) Analysen 35
3.11.4 Zylotoxizitätstest
36
4 ERGEBNISSE ^1 f!^
4.1.2 Genenerung des rekombinanten Rezeptors L49scFv Fc Y (#578) 39
4.1.3 Genenerung des rekombinan.en Rezeptors L49scFv Fc C (#579) 41
4 2 EXPRESSEN DES FUS,ONSPROTE,NS L49SCFV FC «54) \
« NACHWE,S DER EXPRESSE VON MELANOTRANSFERRlN .P^AUFTUMORZELLEN 4.4 B,NDUNG DES FUS,ONSPROTE,NS AN MELANOTRANSFERR.N 442 rn9 r FUSionsproleins L49scFv Fc (#554) an ^—«,::::: 49
4 5 EXPR^l o" I iOnSPrO'einS W9SCFV"FC #554) a" im— Melanotransfernn 51
10 EXPRESSION UND NACHWEIS DER REZEPTOREN
4.5.1 Expression der rekombinanten Rezeptoren #578 und #579^3^ 53
4.5, N sderrekombinan,enRezep,orenim2e,,ysatfransfaierter293T.Zete ;:
4.5.3 Bindung der rekombinanten Rezeptoren #578 und #579 an indirekt immobilisiertes 55
Melanotransferrin (p97) 55
4.6 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER REZEPTORPROTEINE #578 UND #579 58
4.7 EXPRESSION DER REKOMBINANTEN REZEPTOREN AUF DER OBERFLACHE VON LYMPHOZYTEN . 59
4.8 FUNKTIONSANALYSEN DER REZEPTOREN 61
4.8.1 Aktivierung von transduzierten Lymphozyten mit immobilisiertem Antikörper 61
4.8.2 Rezeptor vermittelte Aktivierung von transduzierten Lymphozyten nach Koinkubation 63
mitAntigen positiven Tumorzellen 63
4.9 ZYTOLYSE VON MELANOTRANSFERRIN POSITIVEN TUMORZELLEN DURCH KOKULTIVIERUNG 65
MIT REZEPTOR EXPRIMIERENDEN LYMPHOZYTEN 65
5 DISKUSSION 68
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VORABVERÖFFENTLICHUNG 85
9 ANHANG 86
9.1 NUKLEOTIDSEQUENZ DES FUSIONSPROTEINS L49SCFV FC 86
9.2 NUKLEOTIDSEQUENZ DES REKOMBINANTEN REZEPTORS L49SCFV FC G 89
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