Konstruktion und Charakterisierung von recA-Mutanten von Neisseria meningitidis Serogruppe B:
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Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Zielsetzung 1
2 Einleitung 2
2.1 Neisseria meningitidis 2
2.2 Klinisches Bild einer Menigokokkenerkrankung 3
2.3 Pathogenese und Interaktion mit Zellen 5
2.4 Entwicklung der natürlichen Immunität gegen Meningokokken 6
2.5 Bisherige Impfstoffe gegen N. meningitidis 8
2.6 Ansätze für Impfstoffe basierend auf Membranproteinen 11
2.7 Neue Alternativen in der Impfstoffentwicklung 12
2.8 Lebendvakzine 13
2.9 Natürliche Kompetenz von N. meningitidis und ihre Bedeutung
für die Entwicklung einer Lebendvakzine 15
2.9.1 Natürliche Kompetenz als Basis der genetischen Variabilität bei
Neisserien 15
2.9.2 Kompetenzfaktoren und Mechanismus der Transformation 15
2.9.3 Konsequenzen der natürlichen Kompetenz für die Entwicklung
einer Lebendvakzine 16
3 Material und Methoden 18
3.1 Geräte 18
3.2 Verbrauchsmaterial 19
33 Chemikalien und Reaktionskits 19
3.4 Enzyme 21
3.5 Antikörper 22
3.6 Puffer und Lösungen 22
3.7 Plasmide 24
3.8 Bakterienkulturen 25
Inhaltsverzeichnis
3.5.1 Bakterienstämme 25
3.8.2 Nährmedien 25
3.8.3 Medienzusätze 26
3.8.4 Kulturbedingungen 27
3.9 Oligonukleotide 27
3.10 Computeranalytik 29
3.11 DNA Präparation 29
3.11.1 Midi /Maxi Präparation von Plasmid DANN 29
3.11.2 Mini Präparation von Plasmid DANN 30
3.11.3 Präparation genomischer DNA aus Bakterien 31
3.12 Aufreinigung von DANN 31
3.13 Gelelektrophoresen 31 j
3.13.1 Agarose Gelelektrophorese 31
3.14 Klonierungsmethoden 32 j
3.14.1 Spalten von DNA mittels Restriktionsendonukleasen 32 i
3.14.2 Phosphorylierung von 5 Hydroxylgruppen 32
3.14.3 Auffüllen Überhängender 5 DNA Enden und Abbauen
Überhängender 3 DNA Enden 33
3.14.4 DNA Ugation 33
3.15 Transformation von Bakterien 34
3.15.1 Transformation von E. coli 34
3.15.1.1 Herstellung MgS04 kompetenter£.co/i(Nishimura et al., 1990) 34
3.15.1.2 Transformation MgSOt kompetenter E. coli 35
3.15.2 Transformation von Neisseria meningitidis 35
3.15.2.1 Transformation von Meningokokken, 6h Inkubationszeit 35
3.15.2.2 Transformation von Meningokokken, 3h Inkubationszeit 35
3.15.2.3 Spot Transformations Methode (Gunn und Stein, 1996) 36
3.16 Automatisierte DNA Sequenzierung 36
3.17 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 37
3.18 DNA Hybridisierungen 39
3.18.1 Markierung spezifischer DNA Sonden mit Digoxigenin 39
3.18.2 Transfer von DNA auf Nitrozellulose (Southern Blot) 40
Inhaltsverzeichnis
3.183 DNA DNA Hybridisierung 41
3.18.4 Immunologischer Digoxigenin Nachweis mit CSPD® 41
3.18.5 Strippen der Nylon Membranen 42
3.19 Isolierung, Auftrennung und Analyse von Proteinen 43
3.19.1 Proteingewinnung aus dem gesamten Bakterienzellysat 43
3.19.2 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (Maurer, 1968; Laemmli, 1970) 43
3.19.2.1 Herstellen von SDS Polyacrylamidgelen 43
3.19.2.2 Elektrophoresebedingungen 43
3.19.2.3 Färbung von SDS Polyacrylamidgelen mit Coomassie Blue
(Fazekas de St. Groth et al., 1968) 44
3.19.3 Western Blot (Towbin et al., 1979) 45
3.193.1 Transfer von Proteinen auf eine Nitrozellulosemembran 45
3.193.2 Entwicklung des Western Blots mit Antikörpern 46
3.20 Versuch zur UV Sensitivität von Bakterien 47
3.21 Zellkulturen 47
3.21.1 Materialien 47
3.21.2 HEp2 Zellen 48
3.213 HBMEC 48
3.21.4 Auftauen von permanenten Zelllinien 49
3.21.5 Passagieren und Aussäen von Zellinien 50
3.21.6 Infektionsversuche mit HEp2 Zellen und HBMEC 50
3.21.7 Adhäsions und Invasions Assay (Gentamicin Assay) 50
3.21.8 Dendritische Zellen 51
3.21.8.1 Gewinnung primärer humaner Dendriten aus peripherem Blut 51
3.21.8.2 Infektion von Dendritischen Zellen mit Meningokokken 51
4 Ergebnisse 53
4.1 Funktionelle Deletion des recA Gens in Neisseria meningitidis
Serogruppe B (NMB) als Bestandteil einer Lebendvakzine gegen die
Meningokokken B Meningitis 53
Inhaltsverzeichnis
4.1.1 Konstruktion der rekombinanten recA negati ven NMB Stämme
MC58 recA und H44/76 rec/T 53
4.1.1.1 Konstruktion des recv „Knockout Vektors pSH7 53
4.1.1.2 Transformation der NMB Wildstämme MC 58 und H44/76 mit dem
Hasmid pSH 7 55
4.1.1.3 Überprüfung der rec/i negativen Mutanten mittels PCR 55
4.1.2 Charakterisierung der recA negativen NMB Stämme MC58 recA und
H44/76 recA~ 57
4.1.2.1 Nachweis des mvt Knockout mittels Southern Blot 57
4.1.2.2 Überprüfung des Wachstumsverhaltens der rec/1 Mutanten 58 j
4.1.2.3 Untersuchung der UV Sensitivität der recA negativen Stämme 60
4.1.2.4 Versuche zur Transformationsfähigkeit der rec/1 negativen Mutanten 62
4.1.2.5 Überprüfung der Expression der Oberflächenmarker Pili, Opa und Opc
der recA Mutanten 64
4.2 Infektionsversuche mit den recA negativen NMB Stämme MC58 recA~
und H44/76 recA~ 65
4.2.1 Interaktion der Stämme MC58 recA und H44/76 recA~ mit Hep2
Epithelzellen 66
4.2.2 Interaktion der Stämme MC58 recA und H44/76 recA~ mit humanen
Hirnendothelzellen (HBMEC) 68
4.2.3 Interaktion der Stämme MC58 recA und H44/76 recA~ mit primären
humanen Dendritischen Zellen 71
4.3 Versuche zur Deletion des comA/comZ. Genbereichs in Neisseria
meningitidis Serogruppe B 76
4.3.1 Konstruktion des comA/comL Deletionsvektors pSH2 76
4.3.2 Transformation von Neisseria meningitidis Serogruppe B mit dem
comA/comZ^Deletionsvektor pSH2 79
4.3.3 Konstruktion des comA/com£ Knockout Vektors pSH2 Kana mit
Antibiotikumskassette 80
4.3.4 Transformation von Neisseria meningitidis B mit dem comAlcomL
Knockout Vektor pSH2 Kana 81
j
Inhaltsverzeichnis
5 Diskussion 83
5.1 Funktionelle Deletion des recA Gens in Neisseria meningitidis B im
Hinblick auf eine Lebendvakzine 83
5.2 Charakterisierung der recA negativen NMB Stämme MC58 recA~ und
H44/76 recA 85
5.3 Interaktion der recA negativen NMB Stämme mit Epithel , Endothelzellen
und Dendritischen Zellen 90
5.4 Deletion des comA/comZ, Genbereichs in Neisseria meningitidis B 93
6 Zusammenfassung 97
7 Referenzen 98
8 Anhang 108
Abkürzungen
Lebenslauf
Publikationen
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Zielsetzung 1
2 Einleitung 2
2.1 Neisseria meningitidis 2
2.2 Klinisches Bild einer Menigokokkenerkrankung 3
2.3 Pathogenese und Interaktion mit Zellen 5
2.4 Entwicklung der natürlichen Immunität gegen Meningokokken 6
2.5 Bisherige Impfstoffe gegen N. meningitidis 8
2.6 Ansätze für Impfstoffe basierend auf Membranproteinen 11
2.7 Neue Alternativen in der Impfstoffentwicklung 12
2.8 Lebendvakzine 13
2.9 Natürliche Kompetenz von N. meningitidis und ihre Bedeutung
für die Entwicklung einer Lebendvakzine 15
2.9.1 Natürliche Kompetenz als Basis der genetischen Variabilität bei
Neisserien 15
2.9.2 Kompetenzfaktoren und Mechanismus der Transformation 15
2.9.3 Konsequenzen der natürlichen Kompetenz für die Entwicklung
einer Lebendvakzine 16
3 Material und Methoden 18
3.1 Geräte 18
3.2 Verbrauchsmaterial 19
33 Chemikalien und Reaktionskits 19
3.4 Enzyme 21
3.5 Antikörper 22
3.6 Puffer und Lösungen 22
3.7 Plasmide 24
3.8 Bakterienkulturen 25
Inhaltsverzeichnis
3.5.1 Bakterienstämme 25
3.8.2 Nährmedien 25
3.8.3 Medienzusätze 26
3.8.4 Kulturbedingungen 27
3.9 Oligonukleotide 27
3.10 Computeranalytik 29
3.11 DNA Präparation 29
3.11.1 Midi /Maxi Präparation von Plasmid DANN 29
3.11.2 Mini Präparation von Plasmid DANN 30
3.11.3 Präparation genomischer DNA aus Bakterien 31
3.12 Aufreinigung von DANN 31
3.13 Gelelektrophoresen 31 j
3.13.1 Agarose Gelelektrophorese 31
3.14 Klonierungsmethoden 32 j
3.14.1 Spalten von DNA mittels Restriktionsendonukleasen 32 i
3.14.2 Phosphorylierung von 5' Hydroxylgruppen 32
3.14.3 Auffüllen Überhängender 5' DNA Enden und Abbauen
Überhängender 3' DNA Enden 33
3.14.4 DNA Ugation 33
3.15 Transformation von Bakterien 34
3.15.1 Transformation von E. coli 34
3.15.1.1 Herstellung MgS04 kompetenter£.co/i(Nishimura et al., 1990) 34
3.15.1.2 Transformation MgSOt kompetenter E. coli 35
3.15.2 Transformation von Neisseria meningitidis 35
3.15.2.1 Transformation von Meningokokken, 6h Inkubationszeit 35
3.15.2.2 Transformation von Meningokokken, 3h Inkubationszeit 35
3.15.2.3 Spot Transformations Methode (Gunn und Stein, 1996) 36
3.16 Automatisierte DNA Sequenzierung 36
3.17 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 37
3.18 DNA Hybridisierungen 39
3.18.1 Markierung spezifischer DNA Sonden mit Digoxigenin 39
3.18.2 Transfer von DNA auf Nitrozellulose (Southern Blot) 40
Inhaltsverzeichnis
3.183 DNA DNA Hybridisierung 41
3.18.4 Immunologischer Digoxigenin Nachweis mit CSPD® 41
3.18.5 Strippen der Nylon Membranen 42
3.19 Isolierung, Auftrennung und Analyse von Proteinen 43
3.19.1 Proteingewinnung aus dem gesamten Bakterienzellysat 43
3.19.2 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (Maurer, 1968; Laemmli, 1970) 43
3.19.2.1 Herstellen von SDS Polyacrylamidgelen 43
3.19.2.2 Elektrophoresebedingungen ' 43
3.19.2.3 Färbung von SDS Polyacrylamidgelen mit Coomassie Blue
(Fazekas de St. Groth et al., 1968) 44
3.19.3 Western Blot (Towbin et al., 1979) 45
3.193.1 Transfer von Proteinen auf eine Nitrozellulosemembran 45
3.193.2 Entwicklung des Western Blots mit Antikörpern 46
3.20 Versuch zur UV Sensitivität von Bakterien 47
3.21 Zellkulturen 47
3.21.1 Materialien 47
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3.213 HBMEC 48
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3.21.6 Infektionsversuche mit HEp2 Zellen und HBMEC 50
3.21.7 Adhäsions und Invasions Assay (Gentamicin Assay) 50
3.21.8 Dendritische Zellen 51
3.21.8.1 Gewinnung primärer humaner Dendriten aus peripherem Blut 51
3.21.8.2 Infektion von Dendritischen Zellen mit Meningokokken 51
4 Ergebnisse 53
4.1 Funktionelle Deletion des recA Gens in Neisseria meningitidis
Serogruppe B (NMB) als Bestandteil einer Lebendvakzine gegen die
Meningokokken B Meningitis 53
Inhaltsverzeichnis
4.1.1 Konstruktion der rekombinanten recA negati ven NMB Stämme
MC58 recA und H44/76 rec/T 53
4.1.1.1 Konstruktion des recv\ „Knockout" Vektors pSH7 53
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Hasmid pSH 7 55
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4.1.2.1 Nachweis des mvt Knockout mittels Southern Blot 57
4.1.2.2 Überprüfung des Wachstumsverhaltens der rec/1 Mutanten 58 j
4.1.2.3 Untersuchung der UV Sensitivität der recA negativen Stämme 60
4.1.2.4 Versuche zur Transformationsfähigkeit der rec/1 negativen Mutanten 62
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4.2 Infektionsversuche mit den recA negativen NMB Stämme MC58 recA~
und H44/76 recA~ 65
4.2.1 Interaktion der Stämme MC58 recA' und H44/76 recA~ mit Hep2
Epithelzellen 66
4.2.2 Interaktion der Stämme MC58 recA' und H44/76 recA~ mit humanen
Hirnendothelzellen (HBMEC) 68
4.2.3 Interaktion der Stämme MC58 recA' und H44/76 recA~ mit primären
humanen Dendritischen Zellen 71
4.3 Versuche zur Deletion des comA/comZ. Genbereichs in Neisseria
meningitidis Serogruppe B 76
4.3.1 Konstruktion des comA/comL Deletionsvektors pSH2 76
4.3.2 Transformation von Neisseria meningitidis Serogruppe B mit dem
comA/comZ^Deletionsvektor pSH2 79
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j
Inhaltsverzeichnis
5 Diskussion 83
5.1 Funktionelle Deletion des recA Gens in Neisseria meningitidis B im
Hinblick auf eine Lebendvakzine 83
5.2 Charakterisierung der recA negativen NMB Stämme MC58 recA~ und
H44/76 recA' 85
5.3 Interaktion der recA negativen NMB Stämme mit Epithel , Endothelzellen
und Dendritischen Zellen 90
5.4 Deletion des comA/comZ, Genbereichs in Neisseria meningitidis B 93
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7 Referenzen 98
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