Immunhistochemische Analyse von Haut- und Nierenbiopsien bei der ANCA-assoziierten Vaskulitis am Beispiel der Wegener'schen Granulomatose: eine Untersuchung zur Beurteilung von Proliferation und Apoptose
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Berlin
dissertation.de
2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.........................................................................................................................................3
Abkürzungsverzeichnis.................................................................................................................................5
I.Einleitung..................................................................................................................................................7
1.1.DieANCA-assoziierteVaskulitis(AAV).................................................................................................7
1.1.1. Einteilung der systemischen Vaskulifis..............................................................................................7
1.1.2. Begriffsbestimmung: ANCA-assoziierte Vaskulitis (AAV)..................................................................8
1.1.2.1. Begriffsbestimmung:
1.1.3. Ätiologie und Pathogenese der AAV................................................................................................10
1.1.3.1. Zusammenstellung der pathogenetischen Konzepte der AAV.....................................................10
1.1.3.2. Rolle von prädisponierenden Risikofaktoren bei der Entstehung der AAV...................................14
1.1.4. Klinische Manifestation und Inzidenz der AAV.................................................................................15
1.1.4.1. Einteilung der AAV........................................................................................................................15
1.1.4.2. Die pauci-immune Glomerulonephritis..........................................................................................16
1.1.4.3. Die Wegener sche Granulomatose...............................................................................................17
1.2. Charakteristika der vergleichend untersuchten Glomerulopathien.....................................................19
1.2.1. Die extrakapillär proliferative GN......................................................................................................19
1.2.2. Die mesangioproliferative GN..........................................................................................................20
1.2.3. Die
1.2.4. Die endokapillär proliferative GN......................................................................................................21
1.2.5. Die fokale und segmentale Glomerulosklerose................................................................................22
1.2.6. Die diabetische Nephropathie (diabet. Glomerulosklerose).............................................................23
1.2.7. „minimal
1.3. Apoptose.............................................................................................................................................24
1.3.1. Begriffsbestimmung und historischer Rückblick...............................................................................24
1.3.2. Apoptosemodulierende Proteine......................................................................................................26
1.3.2.1. Das bcl-2 Protein...........................................................................................................................26
1.3.2.1.1. Verteilungsmuster des bcl-2 Proteins in der menschlichen Niere..............................................27
1.3.2.2. Das Fas-Antigen............................................................................................................................28
1.3.2.2.1. Das Fas-Anfigen in der menschlichen Niere..............................................................................29
1.3.3. Apoptose in der Niere.......................................................................................................................30
1.4. Entwicklung und Bedeutung der Thematik..........................................................................................32
1.4.1 Zielstellungen der vorliegenden Arbeit..............................................................................................33
2. Materialien und Methode........................................................................................................................34
2.1. Biopsiematerial....................................................................................................................................34
2.2. Immunchemische Färbemethoden......................................................................................................34
2.2.1. Gewebevorbehandlung....................................................................................................................35
2.2.2. Avidin-Biotin Methode.......................................................................................................................36
2.2.3. Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phopsphatase Technik (APAAP).....................................36
2.3. Nachweis von proliferierenden Zellen.................................................................................................37
2.4. Der Apoptosenachweis........................................................................................................................38
2.4.1. Tunel-AssayOn-situ-nick-translation)...............................................................................................39
2.5. Statistische Auswertung......................................................................................................................41
2.5.1. Statistische Methoden: Regressions- und Korrelationsanalyse.......................................................41
2.5.2. Statistische Testverfahren................................................................................................................43
3. Durchführung..........................................................................................................................................44
3.1. Durchführung der immunchemischen Färbeverfahren ABC und APAAP...........................................44
3.1.1. Gewebevorbehandlung....................................................................................................................44
3.1.1.1. Entparaffinieren.............................................................................................................................44
3.1.1.2.
3.1.1.3. Blockade der endogenen Peroxidase...........................................................................................45
3.1.2. ABC-Technik....................................................................................................................................45
3.1.3. APAAP-Methode..............................................................................................................................46
3.1.4. Kontrollen.........................................................................................................................................48
3.2. TUNEL-Assays....................................................................................................................................48
3.2.1. Gewebevorbereitende Maßnahmen.................................................................................................48
3.2.1.1. Entparaffinieren.............................................................................................................................48
3.2.1.2. Andauen........................................................................................................................................48
3
3.2.1.3. Blockade der endogenen Peroxidase...........................................................................................49
3.2.2. Calbiochem-TdT-FragEL™ DNA
3.2.3. Apoptag-Peroxidase Plus Kit*..........................................................................................................50
3.2.4. Kontrollen..........................................................................................................................................51
4. Ergebnisse..............................................................................................................................................52
4.1. Histomorphologie / Histomorphometrie...............................................................................................52
4.1.1. Apoptose und Proliferation...............................................................................................................53
4.1.1.1. Apoptose........................................................................................................................................53
4.1.1.2. Proliferation....................................................................................................................................56
4.1.3. Nachweis apoptosemodulierender Moleküle (Bcl-2 und
4.1.4. Charakterisierung der infiltrierenden Zellen.....................................................................................63
4.2. Beziehung der einzelnen Parameter zueinander................................................................................67
4.2.1. Vergleich der Glomerulopathien anhand der Mittelwerte der untersuchten Parameter...................67
4.2.1.1. Proliferation....................................................................................................................................68
4.2.1.2. Apoptose........................................................................................................................................69
4.2.1.3. Der Ki-67/TUNEL-Index................................................................................................................70
4.2.1.4. Apoptosemodulierende Proteine...................................................................................................72
4.2.1.5. Infiltrierende Zellen........................................................................................................................75
5. Limitierende Faktoren der Arbeit............................................................................................................77
5.1. Qualität und Quantität der histomorphometrischen Daten..................................................................77
5.1.1. Einflußgröße Nierenbiopsie..............................................................................................................77
5.1.2. Einflußgröße Gewebevorbehandlung...............................................................................................77
5.1.2.1.Fixierung.........................................................................................................................................77
5.1.2.2. „Demaskierung der
5.1.2.3. Der Einfluß der Gewebevorbehandlung auf die Darstellbarkeit apoptotischer Zellen..................79
5.1.3. Fehlerquelle: unspezifische Antikörperbindung................................................................................81
5.1.3.1. Unspezifitäten durch Reaktion des Antikörpers............................................................................81
5.1.3.2. Unspezifität durch Veränderung des antigenen Materials............................................................82
5.1.3.3. Effekt der Hintergrundfärbung.......................................................................................................82
5.2. Ergebnisdiskussion..............................................................................................................................83
5.2.1. Apoptose und Proliferation...............................................................................................................83
5.2.2. bcl-2 und
5.2.2.1. Verteilungsmuster des bcl-2 Proteins............................................................................................85
5.2.2.2. Das Fas-Antigen............................................................................................................................87
5.2.3. Infiltrierende Zellen...........................................................................................................................88
6. Zusammenfassung.................................................................................................................................90
7. Anhang: Tabellen....................................................................................................................................92
8. Quellenverzeichnis.................................................................................................................................98
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.3
Abkürzungsverzeichnis.5
I.Einleitung.7
1.1.DieANCA-assoziierteVaskulitis(AAV).7
1.1.1. Einteilung der systemischen Vaskulifis.7
1.1.2. Begriffsbestimmung: ANCA-assoziierte Vaskulitis (AAV).8
1.1.2.1. Begriffsbestimmung:
1.1.3. Ätiologie und Pathogenese der AAV.10
1.1.3.1. Zusammenstellung der pathogenetischen Konzepte der AAV.10
1.1.3.2. Rolle von prädisponierenden Risikofaktoren bei der Entstehung der AAV.14
1.1.4. Klinische Manifestation und Inzidenz der AAV.15
1.1.4.1. Einteilung der AAV.15
1.1.4.2. Die pauci-immune Glomerulonephritis.16
1.1.4.3. Die Wegener'sche Granulomatose.17
1.2. Charakteristika der vergleichend untersuchten Glomerulopathien.19
1.2.1. Die extrakapillär proliferative GN.19
1.2.2. Die mesangioproliferative GN.20
1.2.3. Die
1.2.4. Die endokapillär proliferative GN.21
1.2.5. Die fokale und segmentale Glomerulosklerose.22
1.2.6. Die diabetische Nephropathie (diabet. Glomerulosklerose).23
1.2.7. „minimal
1.3. Apoptose.24
1.3.1. Begriffsbestimmung und historischer Rückblick.24
1.3.2. Apoptosemodulierende Proteine.26
1.3.2.1. Das bcl-2 Protein.26
1.3.2.1.1. Verteilungsmuster des bcl-2 Proteins in der menschlichen Niere.27
1.3.2.2. Das Fas-Antigen.28
1.3.2.2.1. Das Fas-Anfigen in der menschlichen Niere.29
1.3.3. Apoptose in der Niere.30
1.4. Entwicklung und Bedeutung der Thematik.32
1.4.1 Zielstellungen der vorliegenden Arbeit.33
2. Materialien und Methode.34
2.1. Biopsiematerial.34
2.2. Immunchemische Färbemethoden.34
2.2.1. Gewebevorbehandlung.35
2.2.2. Avidin-Biotin Methode.36
2.2.3. Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phopsphatase Technik (APAAP).36
2.3. Nachweis von proliferierenden Zellen.37
2.4. Der Apoptosenachweis.38
2.4.1. Tunel-AssayOn-situ-nick-translation).39
2.5. Statistische Auswertung.41
2.5.1. Statistische Methoden: Regressions- und Korrelationsanalyse.41
2.5.2. Statistische Testverfahren.43
3. Durchführung.44
3.1. Durchführung der immunchemischen Färbeverfahren ABC und APAAP.44
3.1.1. Gewebevorbehandlung.44
3.1.1.1. Entparaffinieren.44
3.1.1.2.
3.1.1.3. Blockade der endogenen Peroxidase.45
3.1.2. ABC-Technik.45
3.1.3. APAAP-Methode.46
3.1.4. Kontrollen.48
3.2. TUNEL-Assays.48
3.2.1. Gewebevorbereitende Maßnahmen.48
3.2.1.1. Entparaffinieren.48
3.2.1.2. Andauen.48
3
3.2.1.3. Blockade der endogenen Peroxidase.49
3.2.2. Calbiochem-TdT-FragEL™ DNA
3.2.3. Apoptag-Peroxidase Plus Kit*.50
3.2.4. Kontrollen.51
4. Ergebnisse.52
4.1. Histomorphologie / Histomorphometrie.52
4.1.1. Apoptose und Proliferation.53
4.1.1.1. Apoptose.53
4.1.1.2. Proliferation.56
4.1.3. Nachweis apoptosemodulierender Moleküle (Bcl-2 und
4.1.4. Charakterisierung der infiltrierenden Zellen.63
4.2. Beziehung der einzelnen Parameter zueinander.67
4.2.1. Vergleich der Glomerulopathien anhand der Mittelwerte der untersuchten Parameter.67
4.2.1.1. Proliferation.68
4.2.1.2. Apoptose.69
4.2.1.3. Der Ki-67/TUNEL-Index.70
4.2.1.4. Apoptosemodulierende Proteine.72
4.2.1.5. Infiltrierende Zellen.75
5. Limitierende Faktoren der Arbeit.77
5.1. Qualität und Quantität der histomorphometrischen Daten.77
5.1.1. Einflußgröße Nierenbiopsie.77
5.1.2. Einflußgröße Gewebevorbehandlung.77
5.1.2.1.Fixierung.77
5.1.2.2. „Demaskierung" der
5.1.2.3. Der Einfluß der Gewebevorbehandlung auf die Darstellbarkeit apoptotischer Zellen.79
5.1.3. Fehlerquelle: unspezifische Antikörperbindung.81
5.1.3.1. Unspezifitäten durch Reaktion des Antikörpers.81
5.1.3.2. Unspezifität durch Veränderung des antigenen Materials.82
5.1.3.3. Effekt der Hintergrundfärbung.82
5.2. Ergebnisdiskussion.83
5.2.1. Apoptose und Proliferation.83
5.2.2. bcl-2 und
5.2.2.1. Verteilungsmuster des bcl-2 Proteins.85
5.2.2.2. Das Fas-Antigen.87
5.2.3. Infiltrierende Zellen.88
6. Zusammenfassung.90
7. Anhang: Tabellen.92
8. Quellenverzeichnis.98 |
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