Gentherapeutische Inhibition der Angiogenese im hepatozellulären Karzinom durch adenovirale Expression eines löslichen VEGF-Rezeptors im Tiermodell:
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2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung 1
1.1 Hepatozelluläres Karzinom 1
1.2 Angiogenese 2
1.2.1 Einführung in die Thematik 2
1.2.2 Bedeutung der Angiogenese in Physiologie und Pathologie 4
1.2.3 Der Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF) 5
1.2.4 VEGF-Rezeptoren 6
1.2.5 Regulation der Angiogenese 8
1.2.6 Aspekte der Neoangiogenese bei Tumoren 8
1.2.7 Charakteristika von Tumorgefäßen 11
1.2.8 Stand der Antiangiogeneseforschung 11
1.2.9 Potenzielle Probleme einer therapeutischen
Angiogeneseinhibition 14
1.3. Gentherapie 14
1.3.1 Gentherapeutische Konzeptein der Tumortherapie 14
1.3.2 Gentransfer und Vektorsysteme 15
1.4. Adenoviren 16
1.4.1 Adenoviren als Vektorsysteme 16
1.4.2 Verwendete Adenovirus DNA und sflt-1-Gen 17
1.4.3 Transfervektor 18
1.4.4 Ligation des Transfervektors mit der Virus-DNA 18
1.4.5 Virusreplikation 21
1.5 Sequenzierung 21
1.5.1 Primerdesign 22
1.6 Fragestellung, Zielsetzung und Aufbau der Arbeit 24
2. Material und Methoden 26
2.1 Schnitt- und Färbetechniken 26
2.1.1 Material für die Herstellung von Kryoschnitten 26
2.1.2 Herstellung von Kryoschnitten 26
2.1.3 Material für die Durchführung einer HE-Färbung 27
2.1.4 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung von Kryoschnitten 28
2.1.5 Material für die Durchführung der AP-Färbung 28
2.1.6 Histochemische Färbung auf Alkalische Phosphatase 29
2.1.7 Material für die Durchführung der immunhistochemischen Färbung. 30
2.1.8 Durchführung der immunhistochemischen Färbung auf VEGF 31
2.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 34
2.2.1 Kreuzreaktivität des VEGF-ELISA 34
2.2.2 Material für die Durchführung des VEGF-ELISA 35
2.2.3 Vorbereitung zum VEGF-ELISA 35
2.2.4 Durchführung des VEGF-ELISA 36
2.2.5 Material zur Durchführung des sVEGF-RI (sflt-1) ELISA 37
2.2.6 Vorbereitungen zum sVEGF-RI (sflt-1) ELISA 37
2.2.7 Durchführung des sVEGFR-1 (sflt-1) ELISA 38
2.2.8 Auswertung der ELISAs für VEGF und sflt-1 40
2.3 Adenoviren 41
2.3.1 Material für die Propagation von Adenoviren und die Herstellung
von Virusextrakt 42
2.3.2 Propagation von Adenoviren und Herstellung von Adenovirus-
Rohextrakt 42
2.3.3 Material zur Herstellung gereinigter Adenovirus-Lösungen 43
2.3.4 Herstellung gereinigter Adenovirus-Lösungen 44
2.3.5 Material für die Titerbestimmung (Plaque-Assay) 44
2.3.6 Titerbestimmung von Adenovirus-Lösungen 45
2.3.7 Material für Zellfixierung und Kristallviolett-Färbung 45
2.3.8 Zellfixierung und Kristallviolett-Färbung 46
2.3.9 Material für die Isolierung von Adenovirus-DNA 47
2.3.10 Isolierung von Adenovirus-DNA 47
2.4 Allgemeine Zellkultur 48
2.4.1 Material für allgemeine Zellkultur 48
2.4.2 Material für die Zellzählung 49
2.4.3 Zellzählung 49
2.4.4 Material für die Infektion von Zellen mit Adenovirus 50
2.4.5 Infektion von Zellen mit Adenovirus 50
2.5 Spezielle MH-Zellkultur 50
2.5.1 Material für die spezielle MH-Zellkultur 51
2.5.2 Einfrieren von MH-Zellen 51
2.5.3 Auftauen von MH-Zellen 51
2.5.4 Zellpassage und Kultivierung von MH-Zellen 52
2.6 Spezielle HUVEC-Zellkultur 53
2.6.1 Material für die spezielle HUVEC-Zellkultur 53
2.6.2 Vermehren Humaner Umbilikalvenen Endothel Zellen (HUVEC) 54
2.6.3 Einfrieren und Auftauen von HUVEC Zellen 54
2.6.4 Zellpassage und Kultivierung von HUVEC Zellen 55
2.7 Sphäroidassay 56
2.7.1 Material für die Herstellung der Kollagenlösung 56
2.7.2 Herstellung der Kollagenlösung 57
2.7.3 Material für die Herstellung der Methocellösung 59
2.7.4 Herstellung der Methocellösung 59
2.7.5 Material für die Durchführung des Sphäroidassays 60
2.7.6 Vorbereitung für die Herstellung von Sphäroiden 61
2.7.7 Herstellung der Sphäroide 62
2.7.8 Vorbereitung der Sphäroidernte 63
2.7.9 Ernten der Sphäroide und Vorbehandlung 64
2.7.10 Ansetzen des Gels und Einbringen der Sphäroide 65
2.7.11 Aufbringen der Versuchsansätze auf das Gel 65
2.7.12 Stoppen des Sphäroidassays und Auswertung 66
2.8 Das Morris Hepatom Modell der ACI-Ratte 67
2.8.1 Das Morris Hepatom 3924a 67
2.8.2 Die ACI-Ratte als Tiermodell 68
2.8.3 Tierhaltung 68
2.8.4 Material für Narkose und Euthanasierung 68
2.8.5 Narkose und Euthanasierung der Tiere 69
2.8.6 Material zur Aufbereitung und subkutanen Inokulation von MH-
Zellen 69
2.8.7 Aufbereitung von MH-Zellen zur Implantation in eine ACI-Ratte 70
2.8.8 Subkutane Inokulation von MH-Zellen in ACI-Ratten 70
2.8.9 Material für die Herstellung von Viruslösungen und deren
Injektion 71
2.8.10 Herstellung der Viruslösungen für den Einsatz im Tierversuch 71
2.8.11 Injektion von Viruslösung oder NaCI über die Schwanzvene 72
2.8.12 Injektion von Viruslösung oder NaCI in den Subkutantumor 72
2.8.13 Material für Blutentnahme und Serumgewinnung 73
2.8.14 Blutentnahme über die Schwanzvene 73
2.8.15 Blutzentrifugation und Serumgewinnung 73
2.8.16 Material für die Gewebeasservierung 74
2.8.17 Gewebeasservierung 74
3. Ergebnisse 76
3.1 Makroskopische Demonstration der Vaskularisation eines orthotopen
MH-Tumors 76
3.2 Gewebefärbungen 78
3.2.1 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung von MH-Tumoren 78
3.2.2 Darstellung der Gefäße durch histochemische Färbung auf
alkalische Phosphatase 79
3.2.3 Immunhistochemische Färbung von VEGF in MH-Tumoren 83
3.3 Auswertung der Sequenzierung 85
3.4 Expression von VEGF in der MH-Zellkultur 87
3.5 Expression von sflt-1 in der MH-Zellkultur 89
3.6 Expression von sflt-1 in vivo 94
3.7 Vorversuche zum Sphäroidassay 96
3.7.1 Evaluierung der einzusetzenden Mengen an VEGF 96
3.7.2 Hemmung der Aussprossung mit unterschiedlichen Mengen an
sflt-1 98
3.8 Demonstration der Spezifität der Interaktion des VEGF/sflt-1 -Systems
im Sphäroidassay 100
3.9 Versuche mit adenoviral exprimiertem sflt-1 im Sphäroidassay 104
3.9.1 Vergleich unterschiedlicher MH-Zellüberstände im
Sphäroidassay 104
3.9.2 Untersuchung von Tierseren im Sphäroidassay 105
3.10 Tierversuch zur Untersuchung der Wirkung systemisch injizierter
Adenoviren auf subkutane MH-Tumoren 108
3.11 Tierversuch zur Untersuchung der Wirkung lokal injizierter
Adenoviren in subkutane MH-Tumoren 112
4. Diskussion und Schlussfolgerung 115
4.1 Konzept und Versuchsaufbau 115
4.2 Makroskopische und mikroskopische Beurteilung des Morris
Hepatoms 115
4.3 Expressionsnachweise von VEGF und sflt-1 in vitro und in vivo 117
4.4 Funktionalitätsnachweis in vitro durch Sphäroidassay 119
4.5 Tierversuche zur Untersuchung der Funktionalität von sflt-1 in vivo 122
4.6 Schlussfolgerung und Ausblick 125
5. Zusammenfassung 128
6. Anhang 129
6.1 Abkürzungsverzeichnis 129
6.2 Literaturverzeichnis 132
6.3 Danksagung 148
6.4 Lebenslauf 150
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung 1
1.1 Hepatozelluläres Karzinom 1
1.2 Angiogenese 2
1.2.1 Einführung in die Thematik 2
1.2.2 Bedeutung der Angiogenese in Physiologie und Pathologie 4
1.2.3 Der Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF) 5
1.2.4 VEGF-Rezeptoren 6
1.2.5 Regulation der Angiogenese 8
1.2.6 Aspekte der Neoangiogenese bei Tumoren 8
1.2.7 Charakteristika von Tumorgefäßen 11
1.2.8 Stand der Antiangiogeneseforschung 11
1.2.9 Potenzielle Probleme einer therapeutischen
Angiogeneseinhibition 14
1.3. Gentherapie 14
1.3.1 Gentherapeutische Konzeptein der Tumortherapie 14
1.3.2 Gentransfer und Vektorsysteme 15
1.4. Adenoviren 16
1.4.1 Adenoviren als Vektorsysteme 16
1.4.2 Verwendete Adenovirus DNA und sflt-1-Gen 17
1.4.3 Transfervektor 18
1.4.4 Ligation des Transfervektors mit der Virus-DNA 18
1.4.5 Virusreplikation 21
1.5 Sequenzierung 21
1.5.1 Primerdesign 22
1.6 Fragestellung, Zielsetzung und Aufbau der Arbeit 24
2. Material und Methoden 26
2.1 Schnitt- und Färbetechniken 26
2.1.1 Material für die Herstellung von Kryoschnitten 26
2.1.2 Herstellung von Kryoschnitten 26
2.1.3 Material für die Durchführung einer HE-Färbung 27
2.1.4 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung von Kryoschnitten 28
2.1.5 Material für die Durchführung der AP-Färbung 28
2.1.6 Histochemische Färbung auf Alkalische Phosphatase 29
2.1.7 Material für die Durchführung der immunhistochemischen Färbung. 30
2.1.8 Durchführung der immunhistochemischen Färbung auf VEGF 31
2.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 34
2.2.1 Kreuzreaktivität des VEGF-ELISA 34
2.2.2 Material für die Durchführung des VEGF-ELISA 35
2.2.3 Vorbereitung zum VEGF-ELISA 35
2.2.4 Durchführung des VEGF-ELISA 36
2.2.5 Material zur Durchführung des sVEGF-RI (sflt-1) ELISA 37
2.2.6 Vorbereitungen zum sVEGF-RI (sflt-1) ELISA 37
2.2.7 Durchführung des sVEGFR-1 (sflt-1) ELISA 38
2.2.8 Auswertung der ELISAs für VEGF und sflt-1 40
2.3 Adenoviren 41
2.3.1 Material für die Propagation von Adenoviren und die Herstellung
von Virusextrakt 42
2.3.2 Propagation von Adenoviren und Herstellung von Adenovirus-
Rohextrakt 42
2.3.3 Material zur Herstellung gereinigter Adenovirus-Lösungen 43
2.3.4 Herstellung gereinigter Adenovirus-Lösungen 44
2.3.5 Material für die Titerbestimmung (Plaque-Assay) 44
2.3.6 Titerbestimmung von Adenovirus-Lösungen 45
2.3.7 Material für Zellfixierung und Kristallviolett-Färbung 45
2.3.8 Zellfixierung und Kristallviolett-Färbung 46
2.3.9 Material für die Isolierung von Adenovirus-DNA 47
2.3.10 Isolierung von Adenovirus-DNA 47
2.4 Allgemeine Zellkultur 48
2.4.1 Material für allgemeine Zellkultur 48
2.4.2 Material für die Zellzählung 49
2.4.3 Zellzählung 49
2.4.4 Material für die Infektion von Zellen mit Adenovirus 50
2.4.5 Infektion von Zellen mit Adenovirus 50
2.5 Spezielle MH-Zellkultur 50
2.5.1 Material für die spezielle MH-Zellkultur 51
2.5.2 Einfrieren von MH-Zellen 51
2.5.3 Auftauen von MH-Zellen 51
2.5.4 Zellpassage und Kultivierung von MH-Zellen 52
2.6 Spezielle HUVEC-Zellkultur 53
2.6.1 Material für die spezielle HUVEC-Zellkultur 53
2.6.2 Vermehren Humaner Umbilikalvenen Endothel Zellen (HUVEC) 54
2.6.3 Einfrieren und Auftauen von HUVEC Zellen 54
2.6.4 Zellpassage und Kultivierung von HUVEC Zellen 55
2.7 Sphäroidassay 56
2.7.1 Material für die Herstellung der Kollagenlösung 56
2.7.2 Herstellung der Kollagenlösung 57
2.7.3 Material für die Herstellung der Methocellösung 59
2.7.4 Herstellung der Methocellösung 59
2.7.5 Material für die Durchführung des Sphäroidassays 60
2.7.6 Vorbereitung für die Herstellung von Sphäroiden 61
2.7.7 Herstellung der Sphäroide 62
2.7.8 Vorbereitung der Sphäroidernte 63
2.7.9 Ernten der Sphäroide und Vorbehandlung 64
2.7.10 Ansetzen des Gels und Einbringen der Sphäroide 65
2.7.11 Aufbringen der Versuchsansätze auf das Gel 65
2.7.12 Stoppen des Sphäroidassays und Auswertung 66
2.8 Das Morris Hepatom Modell der ACI-Ratte 67
2.8.1 Das Morris Hepatom 3924a 67
2.8.2 Die ACI-Ratte als Tiermodell 68
2.8.3 Tierhaltung 68
2.8.4 Material für Narkose und Euthanasierung 68
2.8.5 Narkose und Euthanasierung der Tiere 69
2.8.6 Material zur Aufbereitung und subkutanen Inokulation von MH-
Zellen 69
2.8.7 Aufbereitung von MH-Zellen zur Implantation in eine ACI-Ratte 70
2.8.8 Subkutane Inokulation von MH-Zellen in ACI-Ratten 70
2.8.9 Material für die Herstellung von Viruslösungen und deren
Injektion 71
2.8.10 Herstellung der Viruslösungen für den Einsatz im Tierversuch 71
2.8.11 Injektion von Viruslösung oder NaCI über die Schwanzvene 72
2.8.12 Injektion von Viruslösung oder NaCI in den Subkutantumor 72
2.8.13 Material für Blutentnahme und Serumgewinnung 73
2.8.14 Blutentnahme über die Schwanzvene 73
2.8.15 Blutzentrifugation und Serumgewinnung 73
2.8.16 Material für die Gewebeasservierung 74
2.8.17 Gewebeasservierung 74
3. Ergebnisse 76
3.1 Makroskopische Demonstration der Vaskularisation eines orthotopen
MH-Tumors 76
3.2 Gewebefärbungen 78
3.2.1 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung von MH-Tumoren 78
3.2.2 Darstellung der Gefäße durch histochemische Färbung auf
alkalische Phosphatase 79
3.2.3 Immunhistochemische Färbung von VEGF in MH-Tumoren 83
3.3 Auswertung der Sequenzierung 85
3.4 Expression von VEGF in der MH-Zellkultur 87
3.5 Expression von sflt-1 in der MH-Zellkultur 89
3.6 Expression von sflt-1 in vivo 94
3.7 Vorversuche zum Sphäroidassay 96
3.7.1 Evaluierung der einzusetzenden Mengen an VEGF 96
3.7.2 Hemmung der Aussprossung mit unterschiedlichen Mengen an
sflt-1 98
3.8 Demonstration der Spezifität der Interaktion des VEGF/sflt-1 -Systems
im Sphäroidassay 100
3.9 Versuche mit adenoviral exprimiertem sflt-1 im Sphäroidassay 104
3.9.1 Vergleich unterschiedlicher MH-Zellüberstände im
Sphäroidassay 104
3.9.2 Untersuchung von Tierseren im Sphäroidassay 105
3.10 Tierversuch zur Untersuchung der Wirkung systemisch injizierter
Adenoviren auf subkutane MH-Tumoren 108
3.11 Tierversuch zur Untersuchung der Wirkung lokal injizierter
Adenoviren in subkutane MH-Tumoren 112
4. Diskussion und Schlussfolgerung 115
4.1 Konzept und Versuchsaufbau 115
4.2 Makroskopische und mikroskopische Beurteilung des Morris
Hepatoms 115
4.3 Expressionsnachweise von VEGF und sflt-1 in vitro und in vivo 117
4.4 Funktionalitätsnachweis in vitro durch Sphäroidassay 119
4.5 Tierversuche zur Untersuchung der Funktionalität von sflt-1 in vivo 122
4.6 Schlussfolgerung und Ausblick 125
5. Zusammenfassung 128
6. Anhang 129
6.1 Abkürzungsverzeichnis 129
6.2 Literaturverzeichnis 132
6.3 Danksagung 148
6.4 Lebenslauf 150 |
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