In-Vitro-Evaluation kombinierter immunologischer und pharmakologischer Therapiestrategien zur Behandlung des Pankreaskarzinoms:
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| Language: | German |
| Published: |
München
Verl. Dr. Hut
2006
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| Edition: | 1. Aufl. |
| Series: | Tiermedizin
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Diss., 2006 |
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Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1 Ziele der Arbeit 1
1.2 Das Pankreaskarzinom 3
1.3 Dendritische Zellen 3
1.3.1 Subtypen dendritischer Zellen 5
1.3.2 Migration, Reifung und T-Zellaktivierung 7
1.3.3 Antigen-Präsentation 10
1.3.3.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex I /
Major Histocompatibility Complex 1 10
1.3.3.2 Der Haupthistokompatibilitätskomplex II /
Major Histocompatibility Complex II 10
1.3.3.3 Kreuz-Präsentation und Klasse-I-Präsentation
exogener Antigene 11
1.3.4 Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen 11
1.3.5 Dendritische Zellen und Toleranz 13
1.3.6 Dendritische Zellen in der Tumortherapie 14
1.4 Tumorgenese- und progredienz begünstigende Faktoren 17
1.4.1 Apoptoseresistenz 17
1.4.1.1 Regulation und Induktion der Apoptose 17
1.4.2 Tumor-Escape Mechanismen 19
1.5 Cyclooxygenase 21
1.5.1 Die Cyclooxygenasen-1 und -2 (COX-1 / COX-2) 21
1.5.2 Cyclooxygenase-2-Expression in Tumoren 21
1.5.3 Die Rolle der Cyclooxygenase-2 in der Karzinogenese
von gastrointestinalen Tumoren 22
1.5.3.1 Das Zusammenspiel von Cyclooxygenase-2
und Angiogenese 22
1.5.3.2 Cyclooxygenase-mediierte Resistenz
gegenüber der Apoptose 23
1.5.4 Tumorspezifische Wirkung der Cyclooxygenase-2-lnhibitoren 23
1.6 Pharmakologische Strategien in Kombination mit einer
dendritischen Zell-basierten Immuntherapie 25
VI
2. MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 Reagenzien, Chemikalien und Geräte 27
2.1.1 Geräte 27
2.1.2 Chemikalien 28
2.1.3 Radioaktive Chemikalien 28
2.1.4 Pharmaka 28
2.1.5 Reagenziensätze 29
2.1.6 Materialien für die Zellkultur 30
2.1.7 Zytokine, Wachstumsstimulatoren und -Stimulanzien 31
2.1.8 Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen 31
2.1.8.1 Lösungen für molekularbiologische Methoden 31
2.1.8.2 Medien und Puffer für Tumorzellen und dendritische Zellen 32
2.1.9 Antikörper 33
2.1.10 Zelllinien 34
2.2 Methoden 34
2.2.1 Zellkultur 35
2.2.1.1 Allgemeine Kulturbedingungen 35
2.2.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Vitalität 35
2.2.1.3 Kultivierung von Tumorzelllinien 35
2.2.2 Aufreinigung von Zellpopulationen 36
2.2.2.1 Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes 36
2.2.2.2 Aufreinigung von Monozyten durch Adhärenz 37
2.2.2.3 Generierung Monozyten-abgeleiteter dendritischer Zellen 38
2.2.2.4 Isolation von T-Zellen 38
2.2.3 Stimulation der in Kokultur befindlichen T-Zellen mit
Antigen-beladenen dendritischen Zellen 39
2.2.3.1 Antigen-Beladung Monozyten-abgeleiteter
dendritischer Zellen 39
2.2.3.2 Kokultur von dendritischen Zellen mit autologen T-Zellen 40
2.2.4 Herstellung von Panc-1 Tumorlysat als Antigenquelle 41
2.3 Analyseverfahren 42
2.3.1 Durchflusszytometrie 42
2.3.1.1 Allgemeines Funktionsprinzip 42
2.3.1.2 Bestimmung von Oberflächenmolekülen 44
VII
2.3.1.3 Lifegate-Analyse 44
2.3.1.4 Identifizierung HLA-A2 positiver Zellen 44
2.3.1.5 Analyse von Zell-Apoptose 45
2.3.2 Zytokinfreie Kultivierung dendritischer Zellen 46
2.3.3 Zellvermittelter Zytotoxizitätstest (51Chrom-Lyse-Test) 46
2.3.4 Enzyme-Iinked immunosorbent assay 48
2.3.5 Proliferations-Analyse der Tumorzellen 49
2.3.6 [3H]-Thymidin Proliferationstest 49
2.3.7 Mikroskopie 51
2.4 Statistische Analyse 52
3. ERGEBNISSE 53
3.1 Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren und
Zytostatika auf Tumorzellen 53
3.1.1 Keine Beeinflussung der CD95-Expression durch
nichtsteroidale Antiphlogistika und Gemcitabin 53
3.1.2 Hemmung der Tumorzellproliferation in Abhängigkeit von Typ
und Dosierung der Pharmaka sowie CD95-Anäkörper-Präsenz 54
3.1.3 Keine Apoptoseinduktion durch Cyclooxygenase-Hemmer
und Zytostatika 59
3.2 Wirkung von nichtsteroidalen Antirheumatika und
Gemcitabin auf dendritische-und T-Zellen 64
3.2.1 Keine Beeinflussung von Viabilität und Reifung
dendritischer Zellen bei Generierung in Gegenwart von
nichtsteroidalen Antirheumatika und Gemcitabin 64
3.2.2 Pharmakon-spezifische Effekte auf die T-Zell-stimulatorische
Kapazität dendritischer Zellen 70
3.3 Steigerung der spezifischen zytotoxischen T-Zell-Lyse
durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 74
3.3.1 Sensititivierung von Tumorzellen gegenüber CD95-abhängiger
T-Zell-Zytotoxizität durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 74
3.3.2 Zytokinproduktion bei Induktion von Antigen-spezifischen
zytotoxischen T-Zellen 76
VIII
4. DISKUSSION 78
4.1 Oberblick über die Ergebnisse 78
4.2 Methodendiskussion 79
4.2.1 Diskussion der verwendeten pharmakologisch aktiven Substanzen... 80
4.2.1.1 Chemotherapeutika 80
4.2.1.2 Nichtsteroidale Antiphlogistika 81
4.2.2 Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (FastDC) 82
4.2.3 Das Pankreaskarzinom in wfro-Modell 84
4.3 Eigene Ergebnisse im Vergleich zur Literatur 86
4.3.1 Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren und
Zytostatika auf Pankreaskarzinomzellen 86
4.3.1.1 Keine Beeinflussung der Oberflächenmarker-Expression
durch nichtsteroidale Antiphlogistika und Gemcitabin 86
4.3.1.2 Nichtsteroidale Antirheumatika- und
Zytostatika-vermittelte Effekte auf Zellproliferation
und Apoptose von Pankreaskarzinomzellen 87
4.3.2 Wirkung von nichtsteroidalen Antirheumatika und
Gemcitabin auf dendritische-und T-Zellen 90
4.3.2.1 Keine Beeinflussung der Reifung und Differenzierung
dendritischer Zellen durch pharmakologisch aktive Substanzen.... 90
4.3.2.2 Pharmakologische Effekte auf die T-Zell-stimulatorische
Kapazität dendritischer Zellen 91
4.3.3 Sensitivierung von Pankreaskarzinomzellen
gegenüber CD95-abhängiger T-Zell-Zytotoxizität
durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 92
4.3.3.1 Induktion einer tumorspezifischen zytotoxischen
T-Zell-Lyse durch Tumorlysat-gepulste dendritische Zellen 92
4.4 Klinische Relevanz 94
5. ZUSAMMENFASSUNG 97
6. SUMMARY 99
7. LITERATURVERZEICHNIS 101
Danksagung 121
Curriculum Vitae 122
|
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V
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1 Ziele der Arbeit 1
1.2 Das Pankreaskarzinom 3
1.3 Dendritische Zellen 3
1.3.1 Subtypen dendritischer Zellen 5
1.3.2 Migration, Reifung und T-Zellaktivierung 7
1.3.3 Antigen-Präsentation 10
1.3.3.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex I /
Major Histocompatibility Complex 1 10
1.3.3.2 Der Haupthistokompatibilitätskomplex II /
Major Histocompatibility Complex II 10
1.3.3.3 Kreuz-Präsentation und Klasse-I-Präsentation
exogener Antigene 11
1.3.4 Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen 11
1.3.5 Dendritische Zellen und Toleranz 13
1.3.6 Dendritische Zellen in der Tumortherapie 14
1.4 Tumorgenese- und progredienz begünstigende Faktoren 17
1.4.1 Apoptoseresistenz 17
1.4.1.1 Regulation und Induktion der Apoptose 17
1.4.2 Tumor-Escape Mechanismen 19
1.5 Cyclooxygenase 21
1.5.1 Die Cyclooxygenasen-1 und -2 (COX-1 / COX-2) 21
1.5.2 Cyclooxygenase-2-Expression in Tumoren 21
1.5.3 Die Rolle der Cyclooxygenase-2 in der Karzinogenese
von gastrointestinalen Tumoren 22
1.5.3.1 Das Zusammenspiel von Cyclooxygenase-2
und Angiogenese 22
1.5.3.2 Cyclooxygenase-mediierte Resistenz
gegenüber der Apoptose 23
1.5.4 Tumorspezifische Wirkung der Cyclooxygenase-2-lnhibitoren 23
1.6 Pharmakologische Strategien in Kombination mit einer
dendritischen Zell-basierten Immuntherapie 25
VI
2. MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 Reagenzien, Chemikalien und Geräte 27
2.1.1 Geräte 27
2.1.2 Chemikalien 28
2.1.3 Radioaktive Chemikalien 28
2.1.4 Pharmaka 28
2.1.5 Reagenziensätze 29
2.1.6 Materialien für die Zellkultur 30
2.1.7 Zytokine, Wachstumsstimulatoren und -Stimulanzien 31
2.1.8 Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen 31
2.1.8.1 Lösungen für molekularbiologische Methoden 31
2.1.8.2 Medien und Puffer für Tumorzellen und dendritische Zellen 32
2.1.9 Antikörper 33
2.1.10 Zelllinien 34
2.2 Methoden 34
2.2.1 Zellkultur 35
2.2.1.1 Allgemeine Kulturbedingungen 35
2.2.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Vitalität 35
2.2.1.3 Kultivierung von Tumorzelllinien 35
2.2.2 Aufreinigung von Zellpopulationen 36
2.2.2.1 Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes 36
2.2.2.2 Aufreinigung von Monozyten durch Adhärenz 37
2.2.2.3 Generierung Monozyten-abgeleiteter dendritischer Zellen 38
2.2.2.4 Isolation von T-Zellen 38
2.2.3 Stimulation der in Kokultur befindlichen T-Zellen mit
Antigen-beladenen dendritischen Zellen 39
2.2.3.1 Antigen-Beladung Monozyten-abgeleiteter
dendritischer Zellen 39
2.2.3.2 Kokultur von dendritischen Zellen mit autologen T-Zellen 40
2.2.4 Herstellung von Panc-1 Tumorlysat als Antigenquelle 41
2.3 Analyseverfahren 42
2.3.1 Durchflusszytometrie 42
2.3.1.1 Allgemeines Funktionsprinzip 42
2.3.1.2 Bestimmung von Oberflächenmolekülen 44
VII
2.3.1.3 Lifegate-Analyse 44
2.3.1.4 Identifizierung HLA-A2 positiver Zellen 44
2.3.1.5 Analyse von Zell-Apoptose 45
2.3.2 Zytokinfreie Kultivierung dendritischer Zellen 46
2.3.3 Zellvermittelter Zytotoxizitätstest (51Chrom-Lyse-Test) 46
2.3.4 Enzyme-Iinked immunosorbent assay 48
2.3.5 Proliferations-Analyse der Tumorzellen 49
2.3.6 [3H]-Thymidin Proliferationstest 49
2.3.7 Mikroskopie 51
2.4 Statistische Analyse 52
3. ERGEBNISSE 53
3.1 Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren und
Zytostatika auf Tumorzellen 53
3.1.1 Keine Beeinflussung der CD95-Expression durch
nichtsteroidale Antiphlogistika und Gemcitabin 53
3.1.2 Hemmung der Tumorzellproliferation in Abhängigkeit von Typ
und Dosierung der Pharmaka sowie CD95-Anäkörper-Präsenz 54
3.1.3 Keine Apoptoseinduktion durch Cyclooxygenase-Hemmer
und Zytostatika 59
3.2 Wirkung von nichtsteroidalen Antirheumatika und
Gemcitabin auf dendritische-und T-Zellen 64
3.2.1 Keine Beeinflussung von Viabilität und Reifung
dendritischer Zellen bei Generierung in Gegenwart von
nichtsteroidalen Antirheumatika und Gemcitabin 64
3.2.2 Pharmakon-spezifische Effekte auf die T-Zell-stimulatorische
Kapazität dendritischer Zellen 70
3.3 Steigerung der spezifischen zytotoxischen T-Zell-Lyse
durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 74
3.3.1 Sensititivierung von Tumorzellen gegenüber CD95-abhängiger
T-Zell-Zytotoxizität durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 74
3.3.2 Zytokinproduktion bei Induktion von Antigen-spezifischen
zytotoxischen T-Zellen 76
VIII
4. DISKUSSION 78
4.1 Oberblick über die Ergebnisse 78
4.2 Methodendiskussion 79
4.2.1 Diskussion der verwendeten pharmakologisch aktiven Substanzen. 80
4.2.1.1 Chemotherapeutika 80
4.2.1.2 Nichtsteroidale Antiphlogistika 81
4.2.2 Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (FastDC) 82
4.2.3 Das Pankreaskarzinom in wfro-Modell 84
4.3 Eigene Ergebnisse im Vergleich zur Literatur 86
4.3.1 Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren und
Zytostatika auf Pankreaskarzinomzellen 86
4.3.1.1 Keine Beeinflussung der Oberflächenmarker-Expression
durch nichtsteroidale Antiphlogistika und Gemcitabin 86
4.3.1.2 Nichtsteroidale Antirheumatika- und
Zytostatika-vermittelte Effekte auf Zellproliferation
und Apoptose von Pankreaskarzinomzellen 87
4.3.2 Wirkung von nichtsteroidalen Antirheumatika und
Gemcitabin auf dendritische-und T-Zellen 90
4.3.2.1 Keine Beeinflussung der Reifung und Differenzierung
dendritischer Zellen durch pharmakologisch aktive Substanzen. 90
4.3.2.2 Pharmakologische Effekte auf die T-Zell-stimulatorische
Kapazität dendritischer Zellen 91
4.3.3 Sensitivierung von Pankreaskarzinomzellen
gegenüber CD95-abhängiger T-Zell-Zytotoxizität
durch einen Cyclooxygenase-2-lnhibitor 92
4.3.3.1 Induktion einer tumorspezifischen zytotoxischen
T-Zell-Lyse durch Tumorlysat-gepulste dendritische Zellen 92
4.4 Klinische Relevanz 94
5. ZUSAMMENFASSUNG 97
6. SUMMARY 99
7. LITERATURVERZEICHNIS 101
Danksagung 121
Curriculum Vitae 122 |
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