Massenisolierung humaner Leberzellen aus transplantationsuntauglichen Spenderorganen:
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2005
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Inhaltsverzeichni s
1 Einleitung 7
1.1 Anwendungsgebiete für isolierte Leberzellen 7
1.2 Zellpopulationen der Leber 8
1.3 Historische Entwicklung der Leberzellisolierungstechniken 11
1.3.1 Leberzellisolierung aus Rattenleber 11
1.3.2 Leberzellisolierung aus Großtierleber 15
1.3.3 Zellisolierung aus humanen Lebern 17
1.4 Das Enzym Kollagenase 20
1.5 Leberzellkultursysteme zur bioartifiziellen Leberunterstützung 22
1.6 Zielsetzung der Arbeit 24
2 Material und Methoden 25
2.1 Organspender und verwendete Organe 25
2.2 Leberperfusionssystem 26
2.3 Kollagenase 28
2.4 Isolierungslösungen 30
2.5 Die fünfschrittige Perfusionsmethode 32
2.6 Aufreinigung der Leberzellen 33
2.7 Bestimmung biochemischer Parameter während der Zellisolierung 34
2.8 Bestimmung der Zellviabilität 36
2.9 Bestimmung der Zellausbeute 37
2.10 in vitro Kultur der isolierten Zellen im Bioreaktor 37
2.11 Bestimmung der Stoffwechselaktivität der kultivierten Zellen 38
2.12 Untersuchungsgruppen 3 9
2.13 Statistik 40
3 Ergebnisse 41
3.1 Gesamtergebnisse aller Zellisolierungen 41
3.2 Spendereigenschaften 42
3.2.1 Zusammenfassung der Spenderdaten 42
3.2.2 Einfluss einzelner Spendereigenschaften auf das Isolierungsergebnis 44
3.3 Organeigenschaften 46
3.3.1 Gründe für den Ausschluss von der Transplantation 46
3.3.2 Einfluss der Art des Leberschadens auf das Isolierungsergebnis 47
6
3.3.3 Einfluss der Kaltischämiezeit auf das Isolierungsergebnis 52
3.3.4 Einfluss des Organgewichts auf das Isolierungsergebnis 53
3.3.5 Einfluss der Konservierungslösung auf das Isolierungsergebnis 54
3.3.6 Einfluss einer Cholecystektomie auf das Isolierungsergebnis 54
3.4 Parameter im Verlauf der Isolierung 55
3.4.1 pH-Wert, Bicarbonatspiegel, Sauerstoff-und Kohlendioxidpartialdruck 55
3.4.2 Enzym- und Kaliumspiegel 60
3.5 Einfluss der Art der Kollagenase auf das Isolierungsergebnis 65
4 Diskussion 69
4.1 Die Humanleber als Zellquelle: Probleme und Alternativen 69
4.2 Bewertung der Methode 70
4.3 Einfluss von Spender- und Transplantateigenschaften auf das Ergebnis 73
4.4 Beurteilung der Parameter im Verlauf der Zellisolierung 75
4.5 Prognostische Relevanz der untersuchten Parameter 77
4.6 Die Verwendung aufgereinigter Enzymmischungen 78
4.7 Grenzen der Aussagekraft der gewonnenen Erkenntnisse 79
4.8 Kritische Betrachtung der Viabilitätsbestimmung 79
4.9 Kritische Betrachtung zur Bestimmung der Ausbeute 82
4.10 Die Harnstoffbildung als Parameter der Stoffwechselaktivität in vitro 83
4.11 Untersuchungen der Leberzellen nach Beendigung der Kultur 85
4.12 Empfehlungen für zukünftige Studien 85
4.13 Ausblick 86
5 Zusammenfassung 88
6 Lebenslauf 90
7 Danksagung 91
8 Erklärung an Eides Statt 91
10 Literaturverzeichnis 92
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5
Inhaltsverzeichni s
1 Einleitung 7
1.1 Anwendungsgebiete für isolierte Leberzellen 7
1.2 Zellpopulationen der Leber 8
1.3 Historische Entwicklung der Leberzellisolierungstechniken 11
1.3.1 Leberzellisolierung aus Rattenleber 11
1.3.2 Leberzellisolierung aus Großtierleber 15
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1.4 Das Enzym Kollagenase 20
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2.7 Bestimmung biochemischer Parameter während der Zellisolierung 34
2.8 Bestimmung der Zellviabilität 36
2.9 Bestimmung der Zellausbeute 37
2.10 in vitro Kultur der isolierten Zellen im Bioreaktor 37
2.11 Bestimmung der Stoffwechselaktivität der kultivierten Zellen 38
2.12 Untersuchungsgruppen 3 9
2.13 Statistik 40
3 Ergebnisse 41
3.1 Gesamtergebnisse aller Zellisolierungen 41
3.2 Spendereigenschaften 42
3.2.1 Zusammenfassung der Spenderdaten 42
3.2.2 Einfluss einzelner Spendereigenschaften auf das Isolierungsergebnis 44
3.3 Organeigenschaften 46
3.3.1 Gründe für den Ausschluss von der Transplantation 46
3.3.2 Einfluss der Art des Leberschadens auf das Isolierungsergebnis 47
6
3.3.3 Einfluss der Kaltischämiezeit auf das Isolierungsergebnis 52
3.3.4 Einfluss des Organgewichts auf das Isolierungsergebnis 53
3.3.5 Einfluss der Konservierungslösung auf das Isolierungsergebnis 54
3.3.6 Einfluss einer Cholecystektomie auf das Isolierungsergebnis 54
3.4 Parameter im Verlauf der Isolierung 55
3.4.1 pH-Wert, Bicarbonatspiegel, Sauerstoff-und Kohlendioxidpartialdruck 55
3.4.2 Enzym- und Kaliumspiegel 60
3.5 Einfluss der Art der Kollagenase auf das Isolierungsergebnis 65
4 Diskussion 69
4.1 Die Humanleber als Zellquelle: Probleme und Alternativen 69
4.2 Bewertung der Methode 70
4.3 Einfluss von Spender- und Transplantateigenschaften auf das Ergebnis 73
4.4 Beurteilung der Parameter im Verlauf der Zellisolierung 75
4.5 Prognostische Relevanz der untersuchten Parameter 77
4.6 Die Verwendung aufgereinigter Enzymmischungen 78
4.7 Grenzen der Aussagekraft der gewonnenen Erkenntnisse 79
4.8 Kritische Betrachtung der Viabilitätsbestimmung 79
4.9 Kritische Betrachtung zur Bestimmung der Ausbeute 82
4.10 Die Harnstoffbildung als Parameter der Stoffwechselaktivität in vitro 83
4.11 Untersuchungen der Leberzellen nach Beendigung der Kultur 85
4.12 Empfehlungen für zukünftige Studien 85
4.13 Ausblick 86
5 Zusammenfassung 88
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7 Danksagung 91
8 Erklärung an Eides Statt 91
10 Literaturverzeichnis 92 |
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