Entwicklung eines phänotypischen Resistenztests zur Messung der Resistenz gegen HIV-Integrase-Inhibitoren:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 HIV Epidemiologie 1
1.2 Verlauf der HIV-Infektion 2
1.3 Therapie der HIV-Erkrankung 4
1.4 Resistenzentwicklung 6
1.5 Resistenztestung 7
1.5.1 Indikationen 7
1.5.1.1 Empfehlungen in Deutschland 7
1.5.1.2 Empfehlungen der EuroGuidelines Group for Resistance 8
1.5.1.3 Empfehlungen in den USA 9
1.5.2 Verfahren 10
1.5.2.1 Genotypisierung 10
1.5.2.2 Phänotypisierung 11
1.5.3 Fazit 13
1.6 Integraseinhibitoren 14
1.7 Der pGJ3 luci Test 16
1.7.1 Vorteile 16
1.7.2 Aufbau des Vektors 16
1.7.3 Herstellung von Vektoren mittels Transfektion 17
1.7.4. Funktionsweise 18
1.7.5 Durchführung 19
1.8 Aufgabenstellung 19
2 Material und Methoden 20
2.1 Material 20
2.1.1 Geräte 20
2.1.2 Verbrauchsmaterialien 21
2.1.3 Chemikalien 22
2.1.4 Enzyme und Kits 24
2.1.5 Integraseinhibitoren 25
2.1.6 Bakterienastämme 25
2.1.7 Zelllinien 25
2.1.8 Virusisolate 25
2.1.9 Plasmide 26
2.1.10 Oligonukleotide 27
2.1.11 Lösungen 28
2.1.11.1 Standardlösungen und Puffer 28
2.1.11.2. Lösungen zur Herstellung kompetenter Bakterien 29
2.1.11.3 Lösungen für die Bakterienkultur 30
2.1.11.4 Lösungen für die Zellkultur 31
2.1.11.5 Lösungen zur Analyse und Klonierung von DNA 32
2.1.11.6 Lösungen für die DNA-Transfektion 34
2.1.11.7 Lösungen zum Nachweis der Luciferaseaktivität 35
2.1.11.8 Lösungen für den Western Blot 37
2.2 Methoden 40
2.2.1 Analyse und Klonierung von DNA 40
2.2.1.1 Herstellung kompetenter Bakterien 40
2.2.1.2 Transformation kompetenter Bakterien 40
2.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien 41
2.2.1.3.1 Mini-Präparation 42
2.2.1.3.2 Maxi-Präparation 42
2.2.4.4 Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung
von Nukleinsäuren 43
2.2.1.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) und PCR-Mutagenese 43
2.2.1.6 Isolierung von RNA aus Virusisolaten 46
2.2.1.7 RT-PCR 46
2.2.1.8 Restriktionsverdau der DNA 47
2.2.1.9 Dephosphorylierung von DNA mit CIAP 48
2.2.1.10 Agarose-Gelelektrophorese 48
2.2.1.11 Gelpräparation von DNA-Fragmenten 48
2.2.1.12 Ligation linearer DNA-Fragmente mit T4-Ligase 49
2.2.1.13 Fällung von DNA 49
2.2.1.14 Sequenzierung von Plasmid-DNA 50
2.2.2 Zellbiologische Methoden 51
2.2.2.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 51
2.2.2.2 Kalziumphosphat-Transfektion 51
2.2.2.3 Infektion von Zielzellen 52
2.2.2.4 Hemmung der Luciferaseexpression durch Zugabe
von Integrase-Inhibitoren 53
2.2.2.5 Nachweis der Luciferaseexpression in infizierten Zellen 53
2.2.2.6 Western Blot 54
2.2.2.6.1 Gewinnung von Proteinlysaten 54
2.2.2.6.2 SDS-Gelelektrophorese 54
2.2.2.6.3 Western Blot mit 0,2% Casein 55
2.2.2.6.4 Western Blot mit 5% Milch 56
3 Ergebnisse 57
3.1 Klonierung von pACI-luci 57
3.2 Klonierung von pACI-Mutanten 60
3.2.1 Klonierung einer defekten Integrase 60
3.2.2 Klonierung von Integrase-Resistenzmutanten 61
3.2.2.1 lntegrasemutanteS153Y 62
3.2.2.2 Integrasemutante M154I 63
3.2.2.3 Integrasemutante T66I mit S153Y 64
3.2.2.4 Integrasemutanten T66I und T66I mit M154I 65
3.3 Testung der Mutanten im Luciferase-Assay 66
3.3.1 Vergleichsmessung von pGJ3-luci und pACI-luci 67
3.3.2 Vergleich von pACI-luci und nfi 199+202 im Luciferase
-Assay 72
3.3.3 Testung der Resistenzmutanten im Luciferase-Assay 74
3.3.3.1 Luciferase-Assay mit ri153 (S153Y) 74
3.3.3.2 Luciferase-Assay mit ri154 (M154I) 76
3.3.3.3 Luciferase-Assay mit ri66+153 (T66I/S153Y) 77
3.3.3.4 Luciferaseassay mit ri66 und ri66+154 (T66I und
T66I/M153I) 79
3.4 Nachweis von viralen Bestandteilen im Western Blot 79
3.5 Amplifikation des POL-Gens aus Virusisolaten 83
4 Diskussion und Ausblick 85
5 Anhang 95
5.1 Abkürzungen 95
5.2 Oligonukleotide 97
5.3 Literatur 99
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 HIV Epidemiologie 1
1.2 Verlauf der HIV-Infektion 2
1.3 Therapie der HIV-Erkrankung 4
1.4 Resistenzentwicklung 6
1.5 Resistenztestung 7
1.5.1 Indikationen 7
1.5.1.1 Empfehlungen in Deutschland 7
1.5.1.2 Empfehlungen der EuroGuidelines Group for Resistance 8
1.5.1.3 Empfehlungen in den USA 9
1.5.2 Verfahren 10
1.5.2.1 Genotypisierung 10
1.5.2.2 Phänotypisierung 11
1.5.3 Fazit 13
1.6 Integraseinhibitoren 14
1.7 Der pGJ3 luci Test 16
1.7.1 Vorteile 16
1.7.2 Aufbau des Vektors 16
1.7.3 Herstellung von Vektoren mittels Transfektion 17
1.7.4. Funktionsweise 18
1.7.5 Durchführung 19
1.8 Aufgabenstellung 19
2 Material und Methoden 20
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2.1.1 Geräte 20
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2.1.3 Chemikalien 22
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2.1.5 Integraseinhibitoren 25
2.1.6 Bakterienastämme 25
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2.1.9 Plasmide 26
2.1.10 Oligonukleotide 27
2.1.11 Lösungen 28
2.1.11.1 Standardlösungen und Puffer 28
2.1.11.2. Lösungen zur Herstellung kompetenter Bakterien 29
2.1.11.3 Lösungen für die Bakterienkultur 30
2.1.11.4 Lösungen für die Zellkultur 31
2.1.11.5 Lösungen zur Analyse und Klonierung von DNA 32
2.1.11.6 Lösungen für die DNA-Transfektion 34
2.1.11.7 Lösungen zum Nachweis der Luciferaseaktivität 35
2.1.11.8 Lösungen für den Western Blot 37
2.2 Methoden 40
2.2.1 Analyse und Klonierung von DNA 40
2.2.1.1 Herstellung kompetenter Bakterien 40
2.2.1.2 Transformation kompetenter Bakterien 40
2.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien 41
2.2.1.3.1 Mini-Präparation 42
2.2.1.3.2 Maxi-Präparation 42
2.2.4.4 Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung
von Nukleinsäuren 43
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2.2.1.6 Isolierung von RNA aus Virusisolaten 46
2.2.1.7 RT-PCR 46
2.2.1.8 Restriktionsverdau der DNA 47
2.2.1.9 Dephosphorylierung von DNA mit CIAP 48
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2.2.1.11 Gelpräparation von DNA-Fragmenten 48
2.2.1.12 Ligation linearer DNA-Fragmente mit T4-Ligase 49
2.2.1.13 Fällung von DNA 49
2.2.1.14 Sequenzierung von Plasmid-DNA 50
2.2.2 Zellbiologische Methoden 51
2.2.2.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 51
2.2.2.2 Kalziumphosphat-Transfektion 51
2.2.2.3 Infektion von Zielzellen 52
2.2.2.4 Hemmung der Luciferaseexpression durch Zugabe
von Integrase-Inhibitoren 53
2.2.2.5 Nachweis der Luciferaseexpression in infizierten Zellen 53
2.2.2.6 Western Blot 54
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2.2.2.6.3 Western Blot mit 0,2% Casein 55
2.2.2.6.4 Western Blot mit 5% Milch 56
3 Ergebnisse 57
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3.3 Testung der Mutanten im Luciferase-Assay 66
3.3.1 Vergleichsmessung von pGJ3-luci und pACI-luci 67
3.3.2 Vergleich von pACI-luci und nfi 199+202 im Luciferase
-Assay 72
3.3.3 Testung der Resistenzmutanten im Luciferase-Assay 74
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3.4 Nachweis von viralen Bestandteilen im Western Blot 79
3.5 Amplifikation des POL-Gens aus Virusisolaten 83
4 Diskussion und Ausblick 85
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5.1 Abkürzungen 95
5.2 Oligonukleotide 97
5.3 Literatur 99 |
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