Funktionelle und biochemische Untersuchungen zur Bedeutung der Phospholamban-Phosphorylierung für die Kraft-Frequenz-Beziehung am nicht-insuffizienten und insuffizienten menschlichen Myokard:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die intrazelluläre Ca2+-Homöostase 1
1.2 Die SERCA 2a und ihre Regulation durch Phospholamban 4
1.3 Die Kraft-Frequenz-Beziehung 5
1.4 Veränderungen in der Ca2*-Homöostase bei der 6
Herzinsuffizienz des Menschen und deren funktionelle
Bedeutung
1.5 Fragestellung der Arbeit 10
2 Methodik 12
2.1 Material 12
2.1.1 Linksventrikuläres Myokard nicht-insuffizienter und terminal 12
insuffizienter (NYHA IV) menschlicher Herzen
2.1.2 Verwendete Substanzen und Lösungen 13
2.1.2.1 Messung der Kontraktionskraft an isolierten Trabekeln 13
2.1.2.2 Simultane Messung der Kontraktionskraft und des 13
intrazellulären Ca2*-Transienten
2.1.2.3 Herstellung Saponin-gehäuteter Herzmuskelfasern 14
2.1.2.4 Messung der Coffein-induzierten Kraftentwicklung an 14
gehäuteten Herzmuskelfasem
2.1.2.5 Homogenisierung des linksventrikulären Gewebes 14
2.1.2.6 Homogenisierung von ventrikulären Trabekeln zur Messung 75
der Phosphorylierung von Phospholamban
2.1.2.7 Rohmembranvesikel-Präparationen des SR zur Messung der 15
SERCA 2a-Aktivität
2.1.2.8 Messung der Aktivität der SERCA 2a 15
2.1.2.9 Quantitative Bestimmung der Proteine 16
2.1.2.10 Gelelektrophorese und Westem-Blots 16
2.2 Funktionelle und biochemische Untersuchungen 17
2.2.1 Messung der isometrischen Kontraktionskraft an 17
multizellulären Herzmuskelpräparaten
2.2.2 Messung des intrazellulären Ca2+-Transienten mit Fura 2 am 18
multizellulären Herzmuskelpräparat
2.2.3 Messung der Coffein-induzierten Ca2+-Freisetzung aus dem 21
Sarkoplasmatischen Retikulum (Coffein-Release)
2.2.3.1 Herstellung Saponin-gehäuteter Herzmuskelfaser-Präparate 21
2.2.3.2 Durchführung der Experimente 22
2.2.4 Gewebepräparationen für Western-Blot-Untersuchungen und 24
zur Bestimmung der SERCA 2a-Aktivität
2.2.4.1 Herstellung von Homogenaten aus linksventrikulärem Myokard 24
und aus linksventrikulären Trabekeln
2.2.4.2 Herstellung von Rohmembranvesikel-Präparationen des SR 25
zur Bestimmung der SERCA 2a-Aktivität
2.2.5 Bestimmung der Aktivität der Ca2+-ATPase des 26
Sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA 2a)
2.2.6 Bestimmung der Proteinexpression von SERCA 2a, 28
Phospholamban und Calsequestrin
2.2.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-Page) 28
2.2.6.2 Bestimmung der Proteinexpression im Westem-Blot 28
2.2.7 Untersuchung des Einflusses von Stimulationsfrequenz und ß- 29
adrenerger Stimulation auf den Phosphorylierungszustand von
Phospholamban
2.3 Statistik 31
3 Ergebnisse 32
3.1 [Ca2*]j in menschlichem insuffizientem und nicht 32
insuffizientem Myokard
3.2 Kraftentwicklung durch Coffein-induzierte Ca2+- 37
Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum
3.3 Aktivität der SERCA 2a 40
3.4 Expression Ca2+-regulierender Proteine in menschlichem 41
nicht insuffizienten und insuffizienten Myokard
3.5 Einfluss der Stimulationsfrequenz auf den 43
Phosphorylierungszustand von Pospholamban
3.6 Einfluss von ß-adrenerger Stimulation auf den 45
Phosphorylierungszustand von Phospholamban
4 Diskussion 47
5 Zusammenfassung 53
6 Literaturverzeichnis 56
7 Vorabveröffentlichungen 67
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die intrazelluläre Ca2+-Homöostase 1
1.2 Die SERCA 2a und ihre Regulation durch Phospholamban 4
1.3 Die Kraft-Frequenz-Beziehung 5
1.4 Veränderungen in der Ca2*-Homöostase bei der 6
Herzinsuffizienz des Menschen und deren funktionelle
Bedeutung
1.5 Fragestellung der Arbeit 10
2 Methodik 12
2.1 Material 12
2.1.1 Linksventrikuläres Myokard nicht-insuffizienter und terminal 12
insuffizienter (NYHA IV) menschlicher Herzen
2.1.2 Verwendete Substanzen und Lösungen 13
2.1.2.1 Messung der Kontraktionskraft an isolierten Trabekeln 13
2.1.2.2 Simultane Messung der Kontraktionskraft und des 13
intrazellulären Ca2*-Transienten
2.1.2.3 Herstellung Saponin-gehäuteter Herzmuskelfasern 14
2.1.2.4 Messung der Coffein-induzierten Kraftentwicklung an 14
gehäuteten Herzmuskelfasem
2.1.2.5 Homogenisierung des linksventrikulären Gewebes 14
2.1.2.6 Homogenisierung von ventrikulären Trabekeln zur Messung 75
der Phosphorylierung von Phospholamban
2.1.2.7 Rohmembranvesikel-Präparationen des SR zur Messung der 15
SERCA 2a-Aktivität
2.1.2.8 Messung der Aktivität der SERCA 2a 15
2.1.2.9 Quantitative Bestimmung der Proteine 16
2.1.2.10 Gelelektrophorese und Westem-Blots 16
2.2 Funktionelle und biochemische Untersuchungen 17
2.2.1 Messung der isometrischen Kontraktionskraft an 17
multizellulären Herzmuskelpräparaten
2.2.2 Messung des intrazellulären Ca2+-Transienten mit Fura 2 am 18
multizellulären Herzmuskelpräparat
2.2.3 Messung der Coffein-induzierten Ca2+-Freisetzung aus dem 21
Sarkoplasmatischen Retikulum (Coffein-Release)
2.2.3.1 Herstellung Saponin-gehäuteter Herzmuskelfaser-Präparate 21
2.2.3.2 Durchführung der Experimente 22
2.2.4 Gewebepräparationen für Western-Blot-Untersuchungen und 24
zur Bestimmung der SERCA 2a-Aktivität
2.2.4.1 Herstellung von Homogenaten aus linksventrikulärem Myokard 24
und aus linksventrikulären Trabekeln
2.2.4.2 Herstellung von Rohmembranvesikel-Präparationen des SR 25
zur Bestimmung der SERCA 2a-Aktivität
2.2.5 Bestimmung der Aktivität der Ca2+-ATPase des 26
Sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA 2a)
2.2.6 Bestimmung der Proteinexpression von SERCA 2a, 28
Phospholamban und Calsequestrin
2.2.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-Page) 28
2.2.6.2 Bestimmung der Proteinexpression im Westem-Blot 28
2.2.7 Untersuchung des Einflusses von Stimulationsfrequenz und ß- 29
adrenerger Stimulation auf den Phosphorylierungszustand von
Phospholamban
2.3 Statistik 31
3 Ergebnisse 32
3.1 [Ca2*]j in menschlichem insuffizientem und nicht 32
insuffizientem Myokard
3.2 Kraftentwicklung durch Coffein-induzierte Ca2+- 37
Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum
3.3 Aktivität der SERCA 2a 40
3.4 Expression Ca2+-regulierender Proteine in menschlichem 41
nicht insuffizienten und insuffizienten Myokard
3.5 Einfluss der Stimulationsfrequenz auf den 43
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3.6 Einfluss von ß-adrenerger Stimulation auf den 45
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5 Zusammenfassung 53
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