Optimierung des Mutationsnachweises im CFTR-Gen von Mukoviszidosepatienten mittels SSCP- (single-strand conformation polymorphismen-) Analyse:
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2005
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|---|---|
| adam_text | I Inhalt
1 Einleitung 1
1.1 Cystische Fibröse 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2 Epidemiologie und Geschichte 1
1.1.3 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 3
1.1.4 Pathophysiologie, Klinik, Therapie und Prognose 6
1.1.5 Genetik 13
1.1.6 Diagnostik 16
1.2 Ziel der Arbeit 20
2 Materialien und Methoden 22
2.1 Überblick 22
2.2 Probengewinnung 22
2.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) 22
2.3.1 Prinzip der PCR 23
2.3.2 Durchführung der PCR 24
2.3.2.1 Geräte und Reagenzien 24
2.3.2.2 PCR Ansätze für die einzelnen Exons und IVS 19 27
2.3.2.3 Thermocycler Programme für die jeweiligen PCR Ansätze 28
2.3.3 Erfolgskontrolle der PCR mittels Elektrophorese 29
2.3.3.1 Prinzip der Agarosegelelektrophorese 29
2.3.3.2 Geräte und Reagenzien 30
2.3.4 Aufreinigung der PCR Produkte 31
2.3.4.1 Prinzip der Aufreinigung 31
2.3.4.2 Geräte und Reagenzien 32
2.4 SSCP (single strand conformation polymorphism ) Analyse 32
2.4.1 Prinzip der SSCP 32
2.4.2 Durchführung der SSCP 35
2.4.3 Geräte und Reagenzien 36
2.4.4 Färben der Polyacrylamidgele 37
3 Ergebnisse 39
3.1 Überblick 39
3.2 Optimierung der SSCP Bedingungen 39
3.3 Qualitative Beurteilung der DNA Aufreinigung 42
3.4 Untersuchung der einzelnen Genabschnitte des CFTR Gens 43
H Inhalt
3.4.1 Exon2 44
3.4.2 Exon 4 45
3.4.3 Exon 7 47
3.4.4 Exon 11 48
3.4.5 Exon 13A 50
3.4.6 Exonl3B 51
3.4.7 Exon 17b 52
3.4.8 Exon 19 54
3.4.9 Exon 20 55
3.4.10 Exon 21 56
3.4.11 Intfonmutation IVS 19 57
3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 57
3.5.1 Materialzusammenstellung 57
3.5.2 Probenanalyse 57
4 Diskussion 60
4.1 SSCP als Methode des Mutationsscreenings 60
4.2 Die untersuchten Mutationen 62
4.2.1 Spektrum der untersuchten Mutationen 62
4.2.2 Die AF508 Mutation 65
4.2.3 Häufigkeit der untersuchten Mutationen 66
4.3 Optimierung der SSCP Bedingungen 68
4.3.1 Wahl der Gelzusammensetzung und des Elektrophoresepuffers 69
4.4 Einfluss der Größe der PCR Produkte 69
4.5 Einfluss der Aufreinigung der PCR Produkte 70
4.6 Einfluss von Temperatur und Laufzeit 72
4.7 Versuchsbedingungen zur Detektion der einzelnen Mutationen 72
4.8 Interpretation der Ergebnisse 73
4.9 Entdeckung einer zuvor unerkannten Mutation (Rl 158X) 76
4.10 Familiendiagnostik mittels SSCP 77
5 Zusammenfassung 7g
6 Literatur 79
7 Abkürzungen 93
8 Lebenslauf 95
9 Danksagung 96
|
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I Inhalt
1 Einleitung 1
1.1 Cystische Fibröse 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2 Epidemiologie und Geschichte 1
1.1.3 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 3
1.1.4 Pathophysiologie, Klinik, Therapie und Prognose 6
1.1.5 Genetik 13
1.1.6 Diagnostik 16
1.2 Ziel der Arbeit 20
2 Materialien und Methoden 22
2.1 Überblick 22
2.2 Probengewinnung 22
2.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) 22
2.3.1 Prinzip der PCR 23
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2.3.2.1 Geräte und Reagenzien 24
2.3.2.2 PCR Ansätze für die einzelnen Exons und IVS 19 27
2.3.2.3 Thermocycler Programme für die jeweiligen PCR Ansätze 28
2.3.3 Erfolgskontrolle der PCR mittels Elektrophorese 29
2.3.3.1 Prinzip der Agarosegelelektrophorese 29
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2.3.4 Aufreinigung der PCR Produkte 31
2.3.4.1 Prinzip der Aufreinigung 31
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2.4.1 Prinzip der SSCP 32
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2.4.4 Färben der Polyacrylamidgele 37
3 Ergebnisse 39
3.1 Überblick 39
3.2 Optimierung der SSCP Bedingungen 39
3.3 Qualitative Beurteilung der DNA Aufreinigung 42
3.4 Untersuchung der einzelnen Genabschnitte des CFTR Gens 43
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3.4.1 Exon2 44
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3.5.1 Materialzusammenstellung 57
3.5.2 Probenanalyse 57
4 Diskussion 60
4.1 SSCP als Methode des Mutationsscreenings 60
4.2 Die untersuchten Mutationen 62
4.2.1 Spektrum der untersuchten Mutationen 62
4.2.2 Die AF508 Mutation 65
4.2.3 Häufigkeit der untersuchten Mutationen 66
4.3 Optimierung der SSCP Bedingungen 68
4.3.1 Wahl der Gelzusammensetzung und des Elektrophoresepuffers 69
4.4 Einfluss der Größe der PCR Produkte 69
4.5 Einfluss der Aufreinigung der PCR Produkte 70
4.6 Einfluss von Temperatur und Laufzeit 72
4.7 Versuchsbedingungen zur Detektion der einzelnen Mutationen 72
4.8 Interpretation der Ergebnisse 73
4.9 Entdeckung einer zuvor unerkannten Mutation (Rl 158X) 76
4.10 Familiendiagnostik mittels SSCP 77
5 Zusammenfassung 7g
6 Literatur 79
7 Abkürzungen 93
8 Lebenslauf 95
9 Danksagung 96 |
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