Selektive Kulturmethoden mit chromogenen Medien und PCR-Methoden zum Nachweis von MRSA direkt aus Nasenabstrichtupfern:
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2005
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|---|---|
| adam_text | 1 Einleitung 9
2 Voraussetzungen: Bedeutung und mikrobiologischer Nachweis von
Methicillin sensiblen und Methicillin resistenten Staphylococcus aureus
(S. aureus) 12
2.1 Staphylococcus aureus (S. aureus) 12
2.2 Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) 13
3 Material und Methoden 16
3.1 Situation am Universitätsklinikum Regensburg 16
3.2 Screening von Risikopatienten 22
3.2.1 Indikationen für das Patientenscreening 22
3.2.2 Darstellung der Risikofaktoren, die zur Aufnahme in das Screening führten
23
3.2.3 Materialien für die Erfassung und die Probenentnahme 24
3.2.4 Erfassung der Patientendaten 25
3.2.5 Genehmigung der Ethikkommmission 25
3.2.6 Probenentnahme und Transport 25
3.3 Diagnostik im Mikrobiologischen Labor am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der Universität Regensburg (RIMMH) 26
3.3.1 Eingangslabor 26
3.3.2 Anlegeplatz 26
3.3.2.1 Verwendete Materialien 26
3.3.2.2 Kulturverfahren in der Routinediagnostik (Blutagar, MSA, MSAL) 27
3.3.2.3 Kulturverfahren in der weiterführenden Diagnostik (ORSAB, CHROM
agar™MRSA) 28
3.3.3 Ableseplätze 28
3.3.3.1 Verwendete Materialien 28
3.3.3.2 Auswertung am 24 Stunden Ableseplatz 29
3.3.3.3 Auswertung am 48 Stunden Ableseplatz 32
3.3.4 Befunderstellung und Mitteilung 33
3.4 Diagnostik im Molekularbiologischen Labor am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der Universität Regensburg (RIMMH) 33
3.4.1 Real time PCR auf dem LightCycler 5.32 (Röche Diagnostics, Mannheim)
zum Nachweis von Staphylococcus aureus, koagulase negativen
Staphylokokken, mecA Gen, humanem ß Globin Gen 34
3.4.1.1 Präanalytik 34
3.4.1.2 Verwendete Materialien 34
3.4.1.3 Durchführung der DNA Isolierung 35
3.4.1.3.1 Extraktion des Abstrichmaterials mit dem S.E.T.S. System 35
3.4.1.3.2 Automatisierte DNA Isolierung mit dem Magna Pure LC 35
3.4.1.3.3 Herstellung der analytischen Master Mix Lösung 36
3.4.1.4 Auswertung und Dokumentation 37
3.4.1.4.1 Analyse der Amplifikationsprodukte 37
3.4.1.4.2 Analyse der internen Kontrolle 37
3.4.1.4.3 Schmelzpunktanalyse 37
3.4.1.4.4 Kriterien für die analytische Freigabe der Ergebnisse 41
3.4.1.4.5 Befundinterpretation 41
3.4.1.4.6 Befunderstellung und mitteilung 41
3.4.1.4.7 Qualitätskontrolle: 43
3.4.2 orfX. real time PCR auf dem lightCycler 5.32 (Röche Diagnostics,
Mannheim) zum Nachweis der or/X Integrationsstelle im Staphylococcal
cassette chromosome mec Element (SCCmec) bei MRSA 43
3.4.2.1 Durchführung der DNA Isolierung 43
3.4.2.1.1 Extraktion des Abstrichmaterials 43
3.4.2.1.2 Automatisierte DNA Isolierung mit dem Magna Pure LC 44
3.4.2.1.3 Herstellung der analytischen Master Mix Lösung 44
3.4.2.2 Auswertung und Dokumentation 44
3.4.2.2.1 Analyse der Amplifikationsprodukte 44
3.4.2.2.2 Analyse der internen Kontrolle 45
3.4.2.2.3 Schmelzpunktanalyse 45
3.4.2.2.4 Befunderstellung und mitteilung 46
3.5 Statistik 46
3.5.1 Datenerfassung und auswertung 46
3.5.2 Sensitivität, Spezifität, Positiver Vorhersagewert (PVW, PPV), Negativer
Vorhersagewert (NVW, NPV) 47
3.5.3 Chi Quadrat Test 48
4 Ergebnisse aus den Diagnostischen Verfahren 49
4.1 Ergebnisse aus den Abstrichen 49
4.1.1 Einfluss des Risikofaktors auf die MRSA Besiedelung 49
4.1.2 Einfluss des stationären Aufenthaltes auf die MRSA Besiedelung 50
4.1.3 Einfluss einer MRSA wirksamen Antibiotikatherapie auf die MRSA
Besiedelung 51
4.2 Auswertung der Kulturergebnisse 51
4.2.1 Routinekulturverfahren (N=531) 51
4.2.2 Selektivnährmedien, Probenumfang N=531 53
4.2.2.1 Mannit Salz Agar mit Lipovitellin (N=531) 53
4.2.2.2 ORSAB 56
4.2.2.3 CHROMagar™MRSA 57
4.3 Auswertung der PCR Ergebnisse 61
4.3.1 Real time PCR zum Nachweis von Staphylococcus aureus, koagulase
negativen Staphylokokken, mecA Gen, humanem ß Globin Gen (Roche
PCR Konzept) 61
4.3.2 Real time PCR zum Nachweis der orfX Integrationsstelle im
„Staphylococcal cassette chromosome mec Element (SCCmec) bei
MRSA 63
4.3.2.1 orfX PCR (N=397) 63
4.3.2.2 orfX PCR(N=531) 64
5 Diskussion 68
5.1 Material und Methoden 69
5.1.1 Erfassung der Patienten 69
5.1.2 Verwendung zweier Tupfer zur Probenentnahme 69
5.1.3 Flüssiganreicherung 70
5.1.4 Ablesezeitpunkt und Licht geschütztes Lagern 70
5.2 Kulturverfahren 71
5.2.1 ORSAB 71
5.2.2 CHROMagar™MRSA 71
5.3 PCR Ergebnisse 75
5.3.1 Roche PCR Konzept 75
5.3.2 orfX PCR 76
6 Zusammenfassung 81
7 Anhang 84
7.1 Literaturverzeichnis 84
7.2 Tabellenverzeichnis 90
7.3 Abbildungsverzeichnis 92
7.4 Produktbeschreibungen 94
7.4.1 Blutagar (53) 94
7.4.2 Mannitol Salz Agar (55) 94
7.4.3 Mannitol Salz Agar mit Lipovitellin (LSM, MSAL) (55) 95
7.4.4 ORSAB (56) 95
7.4.5 CHROMagar™ MRSA (47) 96
7.4.6. DNase Testagar (54) 97
7.4.7. Mueller Hinton Nährboden Oxoid (Art. Nr. CM 337) 98
7.4.8. Slidex® Staph Kit (REF 73 113) Biomerieux®(8) 98
7.4.9. Slidex® MRSA Detection (REF 73 117) Biomerieux® (7) 99
7.5 Beispielberechnung für Chi Quadrat Test 101
7.6 Probenbegleitschein 102
8 Lebenslauf 103
9 Danksagung 104
|
| adam_txt |
1 Einleitung 9
2 Voraussetzungen: Bedeutung und mikrobiologischer Nachweis von
Methicillin sensiblen und Methicillin resistenten Staphylococcus aureus
(S. aureus) 12
2.1 Staphylococcus aureus (S. aureus) 12
2.2 Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) 13
3 Material und Methoden 16
3.1 Situation am Universitätsklinikum Regensburg 16
3.2 Screening von Risikopatienten 22
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3.2.6 Probenentnahme und Transport 25
3.3 Diagnostik im Mikrobiologischen Labor am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der Universität Regensburg (RIMMH) 26
3.3.1 Eingangslabor 26
3.3.2 Anlegeplatz 26
3.3.2.1 Verwendete Materialien 26
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3.3.4 Befunderstellung und Mitteilung 33
3.4 Diagnostik im Molekularbiologischen Labor am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der Universität Regensburg (RIMMH) 33
3.4.1 Real time PCR auf dem LightCycler 5.32 (Röche Diagnostics, Mannheim)
zum Nachweis von Staphylococcus aureus, koagulase negativen
Staphylokokken, mecA Gen, humanem ß Globin Gen 34
3.4.1.1 Präanalytik 34
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3.4.1.3 Durchführung der DNA Isolierung 35
3.4.1.3.1 Extraktion des Abstrichmaterials mit dem S.E.T.S. System 35
3.4.1.3.2 Automatisierte DNA Isolierung mit dem Magna Pure LC 35
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3.4.1.4 Auswertung und Dokumentation 37
3.4.1.4.1 Analyse der Amplifikationsprodukte 37
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3.4.1.4.3 Schmelzpunktanalyse 37
3.4.1.4.4 Kriterien für die analytische Freigabe der Ergebnisse 41
3.4.1.4.5 Befundinterpretation 41
3.4.1.4.6 Befunderstellung und mitteilung 41
3.4.1.4.7 Qualitätskontrolle: 43
3.4.2 orfX. real time PCR auf dem lightCycler 5.32 (Röche Diagnostics,
Mannheim) zum Nachweis der or/X Integrationsstelle im Staphylococcal
cassette chromosome mec Element (SCCmec) bei MRSA 43
3.4.2.1 Durchführung der DNA Isolierung 43
3.4.2.1.1 Extraktion des Abstrichmaterials 43
3.4.2.1.2 Automatisierte DNA Isolierung mit dem Magna Pure LC 44
3.4.2.1.3 Herstellung der analytischen Master Mix Lösung 44
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3.5 Statistik 46
3.5.1 Datenerfassung und auswertung 46
3.5.2 Sensitivität, Spezifität, Positiver Vorhersagewert (PVW, PPV), Negativer
Vorhersagewert (NVW, NPV) 47
3.5.3 Chi Quadrat Test 48
4 Ergebnisse aus den Diagnostischen Verfahren 49
4.1 Ergebnisse aus den Abstrichen 49
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Besiedelung 51
4.2 Auswertung der Kulturergebnisse 51
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5.1 Material und Methoden 69
5.1.1 Erfassung der Patienten 69
5.1.2 Verwendung zweier Tupfer zur Probenentnahme 69
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5.2 Kulturverfahren 71
5.2.1 ORSAB 71
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