Signalwege der NO-induzierten Apoptose in isolierten Kardiomyozyten der adulten Ratte:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Wettenberg
VVB Laufersweiler
2004
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| Edition: | 1. Aufl. |
| Series: | Edition scientifique
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | III, IV, 82 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Verzeichnis der Abkürzungen i
1 Einleitung 1
1.1 Nekrose und Apoptose 1
1.2 Mechanismen und Signalwege der Apoptose 2
1.2.1 Auslöser der Apoptose 2
1.2.2 Signalwege der Apoptose 3
1.3 Apoptose induzierende Faktoren im Herzen 6
1.4 Zellkulturmodell zur Untersuchung der NO induzierten Apoptose 7
1.5 Signalwege der NO induzierten Apoptose 7
1.6 Aufgabenstellung 10
2 Material 11
2.1 Chemikalien 11
2.1.1 Häufig verwendete Chemikalien 11
2.1.2 Inhibitoren, Oligonukleotide 13
2.1.3 Antikörper und PCR Primer 13
2.2 Geräte und Laborbedarf 13
2.2.1 Zellkultur 13
2.2.2 Gelelektrophorese 14
2.2.3 RT PCR und Retardation Assay 14
2.2.4 Sonstige Geräte 15
2.2.5 Verbrauchsmaterialien 15
2.3 Auswertung 16
2.3.1 Hardware 16
2.3.2 Software 16
I
Inhaltsverzeichnis
3 Methoden 17
3.1 Gewinnung isolierter Herzmuskelzellen 17
3.1.1 Versuchstiere 17
3.1.2 Zellpräparation 17
3.2 Kultivierung ventrikulärer Herzmuskelzellen 19
3.2.1 Vorinkubation der Kulturschalen 19
3.2.2 Ausplattieren der Herzmuskelzellen 20
3.3 Versuchsprotokolle 20
3.3.1 Apoptoseinduktion in isolierten Herzmuskelzellen 20
3.3.2 Hemmung der JNK Aktivität 21
3.3.3 Abfangen DNA bindender Proteine mit Hilfe von Decoy
Oligonukleotiden 21
3.4 Apoptosenachweis 23
3.4.1 Quantitativer Apoptosenachweis, HOE Assay 23
3.5 Retardation Assays 25
3.5.1 Zellernte 25
3.5.2 Kernextraktion 25
3.5.3 Oligonukleotide 27
3.5.4 Herstellung radioaktiv markierter Oligonukleotide 27
3.5.5 Spezifische Bindung von Oligonukleotiden an Proteine 29
3.5.6 Retardationgel 30
3.6 Protein Gelelektrophorese 31
3.6.1 Gesamtzelllysate 32
3.6.2 SDS Gel 33
3.6.3 Western Blot Verfahren 34
3.6.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen 35
3.7 mRNA Expressionsanalyse 37
3.7.1 RNA Isolierung 37
3.7.2 Bestimmung des RNA Gehaltes 38
3.7.3 Reverse Transkription 38
3.7.4 PCR 39
II
Inhaltsverzeichnis
3.8 Statistik 42
4 Ergebnisse 43
4.1 Einfluss von NO auf die Apoptose 43
4.2 Rolle der JNK in der NO induzierten Apoptose 44
4.2.1 Expression und Aktivierung der JNK unter dem Einfluss von NO 44
4.2.2 Einfluss der JNK Inhibierung auf die NO induzierte Apoptose 46
4.2.3 Einfluss von JNK auf die AP 1 Bindungsaktivität 47
4.3 Rolle des Transkriptionsfaktors p53 in der NO induzierten Apoptose 48
4.3.1 Einfluss von NO auf die p53 mRNA Expression 48
4.3.2 Einfluss von NO auf die p53 Protein Expression 49
4.3.3 Einfluss von NO auf die Bindungsaktivität von p53 50
4.3.4 Einfluss von p53 auf die NO induzierte Apoptose 53
4.3.5 Regulation der p53 Bindungsaktivität über AP 1 54
4.4 Einfluss der JNK auf die p53 Bindungsaktivität 56
5 Diskussion 58
5.1 Hauptbefunde 58
5.2 JNK 58
5.3 p53 60
5.4 Bedingungen, unter denen p53 zur Apoptose führt 62
5.5 Schlußfolgerung 66
6 Zusammenfassung 68
7 Summary 69
8 Literaturverzeichnis 70
9 Danksagung 81
III
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Verzeichnis der Abkürzungen i
1 Einleitung 1
1.1 Nekrose und Apoptose 1
1.2 Mechanismen und Signalwege der Apoptose 2
1.2.1 Auslöser der Apoptose 2
1.2.2 Signalwege der Apoptose 3
1.3 Apoptose induzierende Faktoren im Herzen 6
1.4 Zellkulturmodell zur Untersuchung der NO induzierten Apoptose 7
1.5 Signalwege der NO induzierten Apoptose 7
1.6 Aufgabenstellung 10
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2.2 Geräte und Laborbedarf 13
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2.2.4 Sonstige Geräte 15
2.2.5 Verbrauchsmaterialien 15
2.3 Auswertung 16
2.3.1 Hardware 16
2.3.2 Software 16
I
Inhaltsverzeichnis
3 Methoden 17
3.1 Gewinnung isolierter Herzmuskelzellen 17
3.1.1 Versuchstiere 17
3.1.2 Zellpräparation 17
3.2 Kultivierung ventrikulärer Herzmuskelzellen 19
3.2.1 Vorinkubation der Kulturschalen 19
3.2.2 Ausplattieren der Herzmuskelzellen 20
3.3 Versuchsprotokolle 20
3.3.1 Apoptoseinduktion in isolierten Herzmuskelzellen 20
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3.5.1 Zellernte 25
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3.5.5 Spezifische Bindung von Oligonukleotiden an Proteine 29
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3.6.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen 35
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3.7.2 Bestimmung des RNA Gehaltes 38
3.7.3 Reverse Transkription 38
3.7.4 PCR 39
II
Inhaltsverzeichnis
3.8 Statistik 42
4 Ergebnisse 43
4.1 Einfluss von NO auf die Apoptose 43
4.2 Rolle der JNK in der NO induzierten Apoptose 44
4.2.1 Expression und Aktivierung der JNK unter dem Einfluss von NO 44
4.2.2 Einfluss der JNK Inhibierung auf die NO induzierte Apoptose 46
4.2.3 Einfluss von JNK auf die AP 1 Bindungsaktivität 47
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4.3.1 Einfluss von NO auf die p53 mRNA Expression 48
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5.1 Hauptbefunde 58
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