Untersuchung von aktinischen Keratosen und Spinaliomen auf das Vorkommen 9-O-acetylierter Ganglioside:
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2004
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
A. Einleitung 1
I. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit 1
II. Definition, Struktur, Vorkommen, Funktion und Stoffwechsel der
Sialinsäuren und Ganglioside 3
1. Definition und Struktur der Sialinsäuren 3
2. Vorkommen von Sialinsäuren 5
3. Funktionen der Sialinsäuren 6
a) Sialinsäuren als Bestandteil von Zellmembranen 6
b) Sialinsäuren als Bestandteil von Glykokonjugaten 8
c) Einzelne Funktionen 9
(1) COO -Gruppe = negative Ladung 9
(2) Schutzschild auf Zellen 9
(3) Antigenes Determinans 10
(4) Signaltransduktion 11
(5) Rezeptorfunktion 11
(6) Funktionen der 9-O-acetylierten Sialinsäuren 12
4. Stoffwechsel der Sialinsäuren und Ganglioside 13
a) Biosynthese 13
b) Abbau der Sialinsäuren und Ganglioside 14
c) Bedeutung verschiedener Enzyme des Sialinsäure- und
Gangliosidstoffwechsels 15
(1) Bedeutung der Sialidasen 15
(2) Bedeutung der Transsialidasen und Sialyltransferasen 16
(3) Bedeutung der CMPNeuöAcHydroxylase 16
d) Medizinische Bedeutung des Gangliosidstoffwechsels 16
B. Material und Methoden 18
I. Material 18
1. Bezugsquellen verwendeter Reagenzien und Proben 18
2. Verbrauchsmaterialien und Geräte 20
3. Verwendete Gewebeproben 22
a) Aktinische Keratosen 22
b) Spinaliome 22
c) Normalhaut 23
II. Methoden 23
1. Extraktion der Ganglioside aus den Paraffinschnitten 23
a) Entparaffinieren 23
b) Abtrennen der Lipide 23
c) Anionenaustauschchromatographie zum Abtrennen der
geladenen Ganglioside 24
(1) Überführen der Sepharose in die Acetatform 24
(2) Anionenaustauschchromatographie 25
d) Entsalzen der Ganglioside 25
2. Auftrennung des Gangliosidgemisches durch
Dünnschichtchromatographie (HPTLC ) 26
a) Erläuterung der HPTLC 26
b) Durchführung der HPTLC 27
3. Detektion der verschiedenen Lipide und Ganglioside auf der HPTLC-
Platte 28
a) Primulin-Reaktion und Densitometrie 28
b) Bial-Reaktion 28
4. Detektion von 9-O-AcGD3 mittels spezifischer Antikörper (Overlay-
Technik, Immunostain, ELISA ) 29
a) Erläuterung des ELISA 29
b) Durchführung des ELISA 29
(1) Vorbereiten der Dünnschichtplatte 29
(2) Antikörperreaktion und Anfärben der Banden 30
(a) Absättigen unspezifischer Bindungsstellen 30
(b) Überschichten mit dem 1. Antikörper 30
(c) Waschen der Platte 30
(d) Überschichten mit dem enzymgekoppelten
Zweitantikörper 30
(e) Waschen der Platte 31
(f) Färben 31
5. Bestimmung der Proteinmenge der Proben aus den Pellets 31
a) Vorbereiten der Proben 31
b) Herstellen von verdünnten Proben 31
c) Füllen der Mikrotiterplatte und Herstellen einer Eichgerade ....32
6. Qualitative und Quantitative Detektion freier Sialinsäuren mittels
fluorimetrischer HPLC 32
a) Erläuterung der HPLC 32
b) Auswertung der HPLC 35
c) Durchführung der HPLC 36
(1) Sialinsäurefreisetzung durch Hydrolyse 36
(2) Derivatisierung der Sialinsäuren 36
(a) Herstellung des DMB-Reagenz 36
(b) Behandlung einer Probe mit Lyase 37
(c) Verseifung der Probe 37
(3) Einspritzen der Proben in die HPLC-Schleife: 37
C. Ergebnisse 38
I. Untersuchung von aktinischen Keratosen, Spinaliomen und Normalhaut
mittels Dünnschichtchromatographie 38
1. Aktinische Keratosen 38
2. Spinaliome 40
3. Normalhaut 42
4. Ergebnisse der Densitometrie 43
II. Testen der Proben auf 9-O-AcGD3 mittels Antikörper 45
1. Aktinische Keratosen 45
2. Spinaliome 46
3. Normalhaut 47
III. Bestimmung der Proteinmenge aus dem Sediment 48
IV. Analyse der Sialinsäuren in den Proben mittels HPLC 49
1. Einzelergebnisse der Proben 49
a) Aktinische Keratosen 49
(1) Qualitative Ergebnisse 49
(2) Quantitative Ergebnisse 52
b) Spinaliome 54
(1) Qualitative Ergebnisse 54
(2) Quantitative Ergebnisse 56
c) Normalhaut 57
(1) Qualitative Ergebnisse 57
(2) Quantitative Ergebnisse der HPLC 59
2. Vergleich der HPLC-Ergebnisse untereinander 59
D. Diskussion 63
I. Zusammenfassung und Auswertung der Ergebnisse 63
1. Proben und Aufarbeitung 63
2. HPTLC 64
3. ELISA 65
4. HPLC der Lipidfraktionen unter Einbeziehung der Ergebnisse aus
der HPTLC und dem ELISA 67
5. HPLC der Proteinfraktionen 71
II. Thesen 71
1. Beurteilung des Gangliosid-Gehalts in aktinischen Keratosen,
Spinaliomen und Normalhaut in Bezug auf den Aufbau der Epidermis.. 71
2. Histologischer Vergleich der Hauptzellkomponenten von aktinischen
Keratosen und Spinaliomen mit Basaliomen und Melanomen 74
3. Histologischer Vergleich der Umgebungsreaktion von Spinaliomen mit
Basaliomen und Melanomen 76
E. Zusammenfassung SO
F. Literaturverzeichnis B3
G. Anhang 92
I. Tabellen 92
II. Abkürzungsverzeichnis 93
Danksagung 97
Lebenslauf 98
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Seite
A. Einleitung 1
I. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit 1
II. Definition, Struktur, Vorkommen, Funktion und Stoffwechsel der
Sialinsäuren und Ganglioside 3
1. Definition und Struktur der Sialinsäuren 3
2. Vorkommen von Sialinsäuren 5
3. Funktionen der Sialinsäuren 6
a) Sialinsäuren als Bestandteil von Zellmembranen 6
b) Sialinsäuren als Bestandteil von Glykokonjugaten 8
c) Einzelne Funktionen 9
(1) COO" -Gruppe = negative Ladung 9
(2) Schutzschild auf Zellen 9
(3) Antigenes Determinans 10
(4) Signaltransduktion 11
(5) Rezeptorfunktion 11
(6) Funktionen der 9-O-acetylierten Sialinsäuren 12
4. Stoffwechsel der Sialinsäuren und Ganglioside 13
a) Biosynthese 13
b) Abbau der Sialinsäuren und Ganglioside 14
c) Bedeutung verschiedener Enzyme des Sialinsäure- und
Gangliosidstoffwechsels 15
(1) Bedeutung der Sialidasen 15
(2) Bedeutung der Transsialidasen und Sialyltransferasen 16
(3) Bedeutung der CMPNeuöAcHydroxylase 16
d) Medizinische Bedeutung des Gangliosidstoffwechsels 16
B. Material und Methoden 18
I. Material 18
1. Bezugsquellen verwendeter Reagenzien und Proben 18
2. Verbrauchsmaterialien und Geräte 20
3. Verwendete Gewebeproben 22
a) Aktinische Keratosen 22
b) Spinaliome 22
c) Normalhaut 23
II. Methoden 23
1. Extraktion der Ganglioside aus den Paraffinschnitten 23
a) Entparaffinieren 23
b) Abtrennen der Lipide 23
c) Anionenaustauschchromatographie zum Abtrennen der
geladenen Ganglioside 24
(1) Überführen der Sepharose in die Acetatform 24
(2) Anionenaustauschchromatographie 25
d) Entsalzen der Ganglioside 25
2. Auftrennung des Gangliosidgemisches durch
Dünnschichtchromatographie (HPTLC ) 26
a) Erläuterung der HPTLC 26
b) Durchführung der HPTLC 27
3. Detektion der verschiedenen Lipide und Ganglioside auf der HPTLC-
Platte 28
a) Primulin-Reaktion und Densitometrie 28
b) Bial-Reaktion 28
4. Detektion von 9-O-AcGD3 mittels spezifischer Antikörper (Overlay-
Technik, Immunostain, ELISA ) 29
a) Erläuterung des ELISA 29
b) Durchführung des ELISA 29
(1) Vorbereiten der Dünnschichtplatte 29
(2) Antikörperreaktion und Anfärben der Banden 30
(a) Absättigen unspezifischer Bindungsstellen 30
(b) Überschichten mit dem 1. Antikörper 30
(c) Waschen der Platte 30
(d) Überschichten mit dem enzymgekoppelten
Zweitantikörper 30
(e) Waschen der Platte 31
(f) Färben 31
5. Bestimmung der Proteinmenge der Proben aus den Pellets 31
a) Vorbereiten der Proben 31
b) Herstellen von verdünnten Proben 31
c) Füllen der Mikrotiterplatte und Herstellen einer Eichgerade .32
6. Qualitative und Quantitative Detektion freier Sialinsäuren mittels
fluorimetrischer HPLC 32
a) Erläuterung der HPLC 32
b) Auswertung der HPLC 35
c) Durchführung der HPLC 36
(1) Sialinsäurefreisetzung durch Hydrolyse 36
(2) Derivatisierung der Sialinsäuren 36
(a) Herstellung des DMB-Reagenz 36
(b) Behandlung einer Probe mit Lyase 37
(c) Verseifung der Probe 37
(3) Einspritzen der Proben in die HPLC-Schleife: 37
C. Ergebnisse 38
I. Untersuchung von aktinischen Keratosen, Spinaliomen und Normalhaut
mittels Dünnschichtchromatographie 38
1. Aktinische Keratosen 38
2. Spinaliome 40
3. Normalhaut 42
4. Ergebnisse der Densitometrie 43
II. Testen der Proben auf 9-O-AcGD3 mittels Antikörper 45
1. Aktinische Keratosen 45
2. Spinaliome 46
3. Normalhaut 47
III. Bestimmung der Proteinmenge aus dem Sediment 48
IV. Analyse der Sialinsäuren in den Proben mittels HPLC 49
1. Einzelergebnisse der Proben 49
a) Aktinische Keratosen 49
(1) Qualitative Ergebnisse 49
(2) Quantitative Ergebnisse 52
b) Spinaliome 54
(1) Qualitative Ergebnisse 54
(2) Quantitative Ergebnisse 56
c) Normalhaut 57
(1) Qualitative Ergebnisse 57
(2) Quantitative Ergebnisse der HPLC 59
2. Vergleich der HPLC-Ergebnisse untereinander 59
D. Diskussion 63
I. Zusammenfassung und Auswertung der Ergebnisse 63
1. Proben und Aufarbeitung 63
2. HPTLC 64
3. ELISA 65
4. HPLC der Lipidfraktionen unter Einbeziehung der Ergebnisse aus
der HPTLC und dem ELISA 67
5. HPLC der Proteinfraktionen 71
II. Thesen 71
1. Beurteilung des Gangliosid-Gehalts in aktinischen Keratosen,
Spinaliomen und Normalhaut in Bezug auf den Aufbau der Epidermis. 71
2. Histologischer Vergleich der Hauptzellkomponenten von aktinischen
Keratosen und Spinaliomen mit Basaliomen und Melanomen 74
3. Histologischer Vergleich der Umgebungsreaktion von Spinaliomen mit
Basaliomen und Melanomen 76
E. Zusammenfassung SO
F. Literaturverzeichnis B3
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