Charakterisierung von PAST1 und PASR2 und deren Bindung an PACSIN 1:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Einleitung in die Endozytose 1
1.2 Transportwege innerhalb des Endozytosesystems 2
1.3 Eigenschaften und molekulare Ma ker der Kompartimente
des Endozytosesystems 4
1.4 Molekulare Mechanismen und Aufbau der Hüllproteine 7
1.4.1 Clathrin-umhüllte Vesikel 7
1.4.2 COPl-umhüllte Vesikel 9
1.4.3 COPII-umhüllte Vesikel 10
1.4.4 Vesikel-Fusions- Komplexe 10
1.5 Proteine mit EH-Domäne und ihre Rolle in der Endozytose 13
1.5.1 Die EH-Domäne 13
1.5.2 Proteine mit EH-Domäne 14
1.6 Bindungspartner der Proteine ni t EH-Domäne 16
1.7 Die PACSINe 18
1.7.1 Analyse der Proteinsequenz 19
1.7.2 Expression der PASCINe 19
1.7.3 Bindungsvei halten der PACSINe 20
1.7.4 Potentielle Funktion der PACSINe 20
1.8 Zielsetzung der Arbeit 22
2 Material 23
2.1 Lösungen und Puffer 23
2.2 Enzyme 29
2.3 Nährmedien 30
2.4 Biologisches Material 30
2.5 Antikörper 31
2.6 Klonierungs- und Expressionsvektoren 32
2.7 Primer 32
2.8 Geräte 33
2.9 Verbrauchsmaterial 34
3 Methoden 35
3.1 Molekularbiologie 35
3.1.1 Piaparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 35
3.1.2 Restriktion von DNA mit EndonukJeasen 37
3.1.3 Analyse der DNA-Restriktion durch Gelelektrophorese 38
3.1.4 Elution von Plasmid-DNA aus einem Agarosegel 39
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration 39
3.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten 40
3.1.7 Herstellung kompetenter Bakterien 41
3.1.8 Transformation von Bakterien mit DNA 42
3.1.9 DNA-Sequenzierung 42
3.1.10 Screenen der Lambda ZAP II Library 43
3.1.11 Die in vivo Exzission 46
3.1.12 Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 47
3.1.13 Der Southern Blot 48
3.1.14 Präparation von GesamtRNA 49
3.1.15 Praparation von mRNA 50
3.1.16 Bestimmung der RNA-Konzentration 51
3.1.17 Elektrophoretische Auftrennung von RNA 51
3.1.18 Der Northern Blot 52
3.1.19 Der Humane RNA Master Blot 52
3.2 Zellkultur und Immunfluoreszenz 54
3.2.1 Allgemeine Arbeitstechniken in der Zellkultur 54
3.2.2 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen 56
3.2.3 Immunfluoreszenz 57
3.2.4 Die konfokale Mikroskopie 58
3.3 Das Two-Hybrid System 58
4 Ergebnisse 61
4.1 Isolierung von PAST1 und PAST2 61
4.1.1 Screenen einer Maushirn cDNA Bank 62
4.1.2 Sequenzanalyse des cDNA Klon 3e 64
4.1.3 Klonierung der kompletten PAST2 Sequenz 64
4.2 Sequenzanalyse der PAST-Proteine 65
4.2.1 Analyse der DNA-Sequenzen 65
4.2.2 Analyse der Proteinsequenzen 66
4.2.3 Die Familie der PAST/EHD Proteine 67
4.2.4 Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen mit EH-Domäne 69
4.2.5 Ähnlichkeiten zu GTPasen 69
4.3 Interaktion von PACSIN I mit den PAST-Proteinen 70
4.3.1 Klonierung der PACSIN I Mutanten 70
4.3.2 Klonierung der PAST2 A EH-Deletionsmutante 71
4.3.3 Two-Hybncl Analyse der PACSIN 1-PAST1 und 2 Interaktion 72
4.4 Analyse der PAST Expressionen 73
4.5 Analyse der PAST 1 und 2 Proteinverteilung in Zellen 76
4.5.1 Herstellung der Expressionskonstmkte von PAST 1 und 2 76
4.5.2 Intrazelluläre Lokalisation von PAST 1 und PAST2 79
4.5.3 Kolokalisation von PAST-Proteinen mit PACSIN 1 80
4.5.4 Kolokalisation von PAST-Proteinen mit endozytotischen Proteinen.
Zellorganellen und dem Zytoskelett 81
5 Diskussion 86
5.1 Interpretation der Sequenzanalyse der Proteine PAST1
und PAST2 87
5.2 Funktionelle Analyse des Bindungspartners PACSIN I 88
5.3 Expression der PAST-Formen 90
5.4 Immunfloureszenzanalysen 91
5.5 Potentielle Funktion der PAST/EHD-Proteine 94
5.6 Ausblick 97
6 Zusammenfassung 99
7 Literaturverzeichnis 100
8 Anhang 115
8.1 Aminosäure- und Nukleotidsequenz von PAST 1 und PAST2 115
8.2 Linkersequenzen 117
9 Lebenslauf 118
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Einleitung in die Endozytose 1
1.2 Transportwege innerhalb des Endozytosesystems 2
1.3 Eigenschaften und molekulare Ma "ker der Kompartimente
des Endozytosesystems 4
1.4 Molekulare Mechanismen und Aufbau der Hüllproteine 7
1.4.1 Clathrin-umhüllte Vesikel 7
1.4.2 COPl-umhüllte Vesikel 9
1.4.3 COPII-umhüllte Vesikel 10
1.4.4 Vesikel-Fusions- Komplexe 10
1.5 Proteine mit EH-Domäne und ihre Rolle in der Endozytose 13
1.5.1 Die EH-Domäne 13
1.5.2 Proteine mit EH-Domäne 14
1.6 Bindungspartner der Proteine ni t EH-Domäne 16
1.7 Die PACSINe 18
1.7.1 Analyse der Proteinsequenz 19
1.7.2 Expression der PASCINe 19
1.7.3 Bindungsvei halten der PACSINe 20
1.7.4 Potentielle Funktion der PACSINe 20
1.8 Zielsetzung der Arbeit 22
2 Material 23
2.1 Lösungen und Puffer 23
2.2 Enzyme 29
2.3 Nährmedien 30
2.4 Biologisches Material 30
2.5 Antikörper 31
2.6 Klonierungs- und Expressionsvektoren 32
2.7 Primer 32
2.8 Geräte 33
2.9 Verbrauchsmaterial 34
3 Methoden 35
3.1 Molekularbiologie 35
3.1.1 Piaparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 35
3.1.2 Restriktion von DNA mit EndonukJeasen 37
3.1.3 Analyse der DNA-Restriktion durch Gelelektrophorese 38
3.1.4 Elution von Plasmid-DNA aus einem Agarosegel 39
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration 39
3.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten 40
3.1.7 Herstellung kompetenter Bakterien 41
3.1.8 Transformation von Bakterien mit DNA 42
3.1.9 DNA-Sequenzierung 42
3.1.10 Screenen der Lambda ZAP II Library 43
3.1.11 Die in vivo Exzission 46
3.1.12 Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 47
3.1.13 Der Southern Blot 48
3.1.14 Präparation von GesamtRNA 49
3.1.15 Praparation von mRNA 50
3.1.16 Bestimmung der RNA-Konzentration 51
3.1.17 Elektrophoretische Auftrennung von RNA 51
3.1.18 Der Northern Blot 52
3.1.19 Der Humane RNA Master Blot 52
3.2 Zellkultur und Immunfluoreszenz 54
3.2.1 Allgemeine Arbeitstechniken in der Zellkultur 54
3.2.2 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen 56
3.2.3 Immunfluoreszenz 57
3.2.4 Die konfokale Mikroskopie 58
3.3 Das Two-Hybrid System 58
4 Ergebnisse 61
4.1 Isolierung von PAST1 und PAST2 61
4.1.1 Screenen einer Maushirn cDNA Bank 62
4.1.2 Sequenzanalyse des cDNA Klon 3e 64
4.1.3 Klonierung der kompletten PAST2 Sequenz 64
4.2 Sequenzanalyse der PAST-Proteine 65
4.2.1 Analyse der DNA-Sequenzen 65
4.2.2 Analyse der Proteinsequenzen 66
4.2.3 Die Familie der PAST/EHD Proteine 67
4.2.4 Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen mit EH-Domäne 69
4.2.5 Ähnlichkeiten zu GTPasen 69
4.3 Interaktion von PACSIN I mit den PAST-Proteinen 70
4.3.1 Klonierung der PACSIN I Mutanten 70
4.3.2 Klonierung der PAST2 A EH-Deletionsmutante 71
4.3.3 Two-Hybncl Analyse der PACSIN 1-PAST1 und 2 Interaktion 72
4.4 Analyse der PAST Expressionen 73
4.5 Analyse der PAST 1 und 2 Proteinverteilung in Zellen 76
4.5.1 Herstellung der Expressionskonstmkte von PAST 1 und 2 76
4.5.2 Intrazelluläre Lokalisation von PAST 1 und PAST2 79
4.5.3 Kolokalisation von PAST-Proteinen mit PACSIN 1 80
4.5.4 Kolokalisation von PAST-Proteinen mit endozytotischen Proteinen.
Zellorganellen und dem Zytoskelett 81
5 Diskussion 86
5.1 Interpretation der Sequenzanalyse der Proteine PAST1
und PAST2 87
5.2 Funktionelle Analyse des Bindungspartners PACSIN I 88
5.3 Expression der PAST-Formen 90
5.4 Immunfloureszenzanalysen 91
5.5 Potentielle Funktion der PAST/EHD-Proteine 94
5.6 Ausblick 97
6 Zusammenfassung 99
7 Literaturverzeichnis 100
8 Anhang 115
8.1 Aminosäure- und Nukleotidsequenz von PAST 1 und PAST2 115
8.2 Linkersequenzen 117
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