Selektive Expression von PET-Markergenen in Neuronen und Gliazellen mittels zellspezifischer Promotorelemente in HSV-1 Amplikon-Vektoren:
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2005
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungen.... 5
1. Einleitung . 7
1.1 Hintergrund des Projektes 10
1.1.1. Gentherapeutische Aspekte 10
1.1.2. Markergene 11
1.1.3. Koexpression 12
1.1.4. HSV-1 und das helfervirusfreie Verpackungssystem 13
1.2 Zellspezifische Promotorelemente 14
1.3 Zellkulturmodelle 19
1.4 Fragestellung der Arbeit 20
2. Material und Methoden... 21
2.1 Klonierung der Plasmide 21
2.1.1 pHSV-GFAP-TG17 21
2.1.2 pHSV-TH-TG17 22
2.1.3 pHSV-PDGF-TG17-WPRE 22
2.1.4 pHSV-NSE-TG17 23
2.2 Zelllinien 24
2.3 Helfervirusfreie Verpackung von HSV-1 Amplikon-Plasmiaen in HSV1 Virione 25
2.3.1 Vorbereitung der Cosmide 25
2.3.2 Kotransfektion von Amplikon und Cosmiden 25
2.3.3 Ernten des Virus, Aufreinigung und Konzentrierung 26
2.3.4 Titration 27
2.4 Infektion von Zelllinien mit HSV-1 Amplikon-Virionen 27
2.5 GFP-Quantifizierung 28
2.5.1 Statistik 28
2.6 Primärkulturen 29
2
2.6.1 Vorbereitung der Platten 29
2.6.2 Präparation der Cortices 30
2.6.3 Reifung der Kulturen 30
2.6.4 Virusinfektion der Primärkultur 31
2.7 Indirekte Immunfluoreszenz -^
2.7.1 Fixierung der Zellen 31
2.7.2 Antikörperbindung 32
2.7.3 Doppelimmunfluoreszenz 33
2.7.4 Fluoreszenzmikroskopie 34
3. Ergebnisse 36
3.1 Konstruktion von HSV-I Amplikon-Vektoren mit zellspezifischen Promotorregionen 36
3.1.1 Klonierungen 36
3.1.2 Verpackung und Titration 36
3.2 Promotoraktmtät in Zelllinien 38
3.2.1 Quantifizierung der GFP-Expression in GH36 Gliomzellen 43
3.2.2 Quantifizierung der GFP-Expression in SHSY5Y Neuroblastomzellen 44
3.2.3 Quantifizierung der GFP-Expression in undifferenzicrten NT2-Zellen 44
3.2.4 Quantifizierung der GFP-Expression in Vero 2-2 Zellen 44
3.2.5 Quantifizierung der GFP-Expression in BHK-Zellen 45
3.2.6 Fluoreszenz von TG17 und GFP 45
3.2.7 GFP-Expression in GU36 und GH36AEGFR 45
3.3 Etablierung einer Primärkultur als Kokulturmodell 49
3.3.1 Charakterisierung der Kultur: Identifizierung verschiedener Zelltypen und Antikörperspezifität.... 49
3.3.2 Spezifische Expression von Markergenen in Zelltypen der Kokultur in MEM 53
3.3.3 Quantifizierung der spezifischen Expression von Markergenen in MEM 60
3.3.4 Medium, Dichte und Differenzierung in MEM oder Neurobasalmedium 64
3.3.5 Quantifizierung der spezifischen Expression von Markergenen in Neurobasalmedium 68
4. Diskussion 70
4.1 GFAP-Promotor 70
4.2 TH-Promotor 73
4.3 PDGF-ß-Promotor 75
4.4 NSE-Promotor 78
4.5 HSV-1 als Vektor 79
4.6 GFP-Quantißzierung 80
4.7 Primärkultur 82
4.8 Ausblick 85
5. Zusammenfassung »7
3
6. Literaturverzeichnis „....„ 89
7. Abbildungen 97
8. Anhang « 98
9. Lebenslauf,.....,..™........™..........™^ 103
97
7. Abbildungen
Seite
Abbildung 1: HSV-1 Amplikon-Plasmide 37
Abbildung 2: Repräsentative Bildausschnitte am Epifluoreszenzmikroskop für die GFP-
Quantifizierung in den Zelllinien: GU36, SHSY5Y, NT2, Vero 2-2 und BHK 39
Abbildung 3: Zelllinien- und Promotor-abhängige Quantifizierung der GFP-Fluoreszenz,
Darstellung getrennt nach Zelllinien 43
Abbildung 4: Quantifizierung der Promotoraktivität in GH36 Zellen und GÜ36AEGFR
Zellen 46
Abbildung 5: Zelllinien- und Promotor-abhängige Quantifizierung der GFP-Fluoreszenz... 48
Abbildung 6: Antikörperspezifität von GFAP- und MAP-2-Antikörpern in Primärkulturen. 50
Abbildung 7: Charakterisierung der reifen Primärkulturen mit GFAP, MAP-2 und NeuN
Antikörpern im LSM 51
Abbildung 8: Kolokalisation der Promotor-vermittelten GFP-Expression mit den neuronalen
und glialen Markern MAP-2 und GFAP 55
Abbildung 9: Quantifizierung der GFP-Expression in Neuronen und Gliazellen in MEM
vermittelt durch verschiedene Promotoren 61
Abbildung 10: Neuronale Differenzierung in Neurobasahnedium 66
Abbildung 11: Gliazelldifferenzierung in Neurobasalmedium 67
Abbildung 12: Quantifizierung der GFP-Expression in Neuronen und Gliazellen in
Neurobasalmedium 69
Abbildung 13: Plasmidkarten der klonierten und untersuchten HSV-1 Amplikon-Piasmide.
100
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Inhaltsverzeichnis
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Abkürzungen. 5
1. Einleitung . 7
1.1 Hintergrund des Projektes 10
1.1.1. Gentherapeutische Aspekte 10
1.1.2. Markergene 11
1.1.3. Koexpression 12
1.1.4. HSV-1 und das helfervirusfreie Verpackungssystem 13
1.2 Zellspezifische Promotorelemente 14
1.3 Zellkulturmodelle 19
1.4 Fragestellung der Arbeit 20
2. Material und Methoden. 21
2.1 Klonierung der Plasmide 21
2.1.1 pHSV-GFAP-TG17 21
2.1.2 pHSV-TH-TG17 22
2.1.3 pHSV-PDGF-TG17-WPRE 22
2.1.4 pHSV-NSE-TG17 23
2.2 Zelllinien 24
2.3 Helfervirusfreie Verpackung von HSV-1 Amplikon-Plasmiaen in HSV1 Virione 25
2.3.1 Vorbereitung der Cosmide 25
2.3.2 Kotransfektion von Amplikon und Cosmiden 25
2.3.3 Ernten des Virus, Aufreinigung und Konzentrierung 26
2.3.4 Titration 27
2.4 Infektion von Zelllinien mit HSV-1 Amplikon-Virionen 27
2.5 GFP-Quantifizierung 28
2.5.1 Statistik 28
2.6 Primärkulturen 29
2
2.6.1 Vorbereitung der Platten 29
2.6.2 Präparation der Cortices 30
2.6.3 Reifung der Kulturen 30
2.6.4 Virusinfektion der Primärkultur 31
2.7 Indirekte Immunfluoreszenz -^
2.7.1 Fixierung der Zellen 31
2.7.2 Antikörperbindung 32
2.7.3 Doppelimmunfluoreszenz 33
2.7.4 Fluoreszenzmikroskopie 34
3. Ergebnisse 36
3.1 Konstruktion von HSV-I Amplikon-Vektoren mit zellspezifischen Promotorregionen 36
3.1.1 Klonierungen 36
3.1.2 Verpackung und Titration 36
3.2 Promotoraktmtät in Zelllinien 38
3.2.1 Quantifizierung der GFP-Expression in GH36 Gliomzellen 43
3.2.2 Quantifizierung der GFP-Expression in SHSY5Y Neuroblastomzellen 44
3.2.3 Quantifizierung der GFP-Expression in undifferenzicrten NT2-Zellen 44
3.2.4 Quantifizierung der GFP-Expression in Vero 2-2 Zellen 44
3.2.5 Quantifizierung der GFP-Expression in BHK-Zellen 45
3.2.6 Fluoreszenz von TG17 und GFP 45
3.2.7 GFP-Expression in GU36 und GH36AEGFR 45
3.3 Etablierung einer Primärkultur als Kokulturmodell 49
3.3.1 Charakterisierung der Kultur: Identifizierung verschiedener Zelltypen und Antikörperspezifität. 49
3.3.2 Spezifische Expression von Markergenen in Zelltypen der Kokultur in MEM 53
3.3.3 Quantifizierung der spezifischen Expression von Markergenen in MEM 60
3.3.4 Medium, Dichte und Differenzierung in MEM oder Neurobasalmedium 64
3.3.5 Quantifizierung der spezifischen Expression von Markergenen in Neurobasalmedium 68
4. Diskussion 70
4.1 GFAP-Promotor 70
4.2 TH-Promotor 73
4.3 PDGF-ß-Promotor 75
4.4 NSE-Promotor 78
4.5 HSV-1 als Vektor 79
4.6 GFP-Quantißzierung 80
4.7 Primärkultur 82
4.8 Ausblick 85
5. Zusammenfassung »7
3
6. Literaturverzeichnis „.„ 89
7. Abbildungen 97
8. Anhang « 98
9. Lebenslauf,.,.™.™.™^ 103
97
7. Abbildungen
Seite
Abbildung 1: HSV-1 Amplikon-Plasmide 37
Abbildung 2: Repräsentative Bildausschnitte am Epifluoreszenzmikroskop für die GFP-
Quantifizierung in den Zelllinien: GU36, SHSY5Y, NT2, Vero 2-2 und BHK 39
Abbildung 3: Zelllinien- und Promotor-abhängige Quantifizierung der GFP-Fluoreszenz,
Darstellung getrennt nach Zelllinien 43
Abbildung 4: Quantifizierung der Promotoraktivität in GH36 Zellen und GÜ36AEGFR
Zellen 46
Abbildung 5: Zelllinien- und Promotor-abhängige Quantifizierung der GFP-Fluoreszenz. 48
Abbildung 6: Antikörperspezifität von GFAP- und MAP-2-Antikörpern in Primärkulturen. 50
Abbildung 7: Charakterisierung der reifen Primärkulturen mit GFAP, MAP-2 und NeuN
Antikörpern im LSM 51
Abbildung 8: Kolokalisation der Promotor-vermittelten GFP-Expression mit den neuronalen
und glialen Markern MAP-2 und GFAP 55
Abbildung 9: Quantifizierung der GFP-Expression in Neuronen und Gliazellen in MEM
vermittelt durch verschiedene Promotoren 61
Abbildung 10: Neuronale Differenzierung in Neurobasahnedium 66
Abbildung 11: Gliazelldifferenzierung in Neurobasalmedium 67
Abbildung 12: Quantifizierung der GFP-Expression in Neuronen und Gliazellen in
Neurobasalmedium 69
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