Molekularbiologische Untersuchungen zur C-Katabolitrepression von extrazellulären Enzymen an Penicillium verruculosum:
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2004
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGEN
UND
FACHBEGRIFFE
.V
L
EINLEITUNG
.
1
1.
REGULATION
DER
CELLULASE-/HEMICELLULASE-EXPRESSION
IN
PILZEN
.4
2.
C-KATABOLITREPRESSION
.
6
2.1
C-KATABOLITREPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE.
7
2.1.1
GLUKOSE-DETEKTION
UND
GLUKOSE-SENSOREN
.
8
2.1.2
GLUKOSE-TRANSPORT
.
9
2.1.3
GLUKOSE-SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE
.
9
2.1.4
MIG1
P
DER
DNA-BINDENDE
REPRESSOR
.
11
2.1.5
MECHANISMUS
DER
GLUKOSE-REPRESSION
IN
5.
CEREVISIAE
.
12
2.2
GLUKOSE-REPRESSION
IN
FILAMENTOESEN
PILZEN
.
14
2.2.1
GLUKOSE-DETEKTION
UND
GLUKOSE-SIGNALGEBUNG
.
14
2.2.2
C-KATABOLITREPRESSOR
CREAP
UND
SEINE
REGULATION
.
15
2.2.3
MECHANISMUS
DER
C-KATABOLITREPRESSION
IN
PILZEN
.
17
3.
ZIELSTELLUNG
.20
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
22
1.
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
KITS
UND
MATERIALIEN
.
22
2.
ORGANISMEN,
PLASMIDE
.
22
2.1
ORGANISMEN
.
22
2.2
PLASMIDE
.
23
3.
MEDIEN
.
25
3.1
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
E.
COLI
.
25
3.1.1
LB
(LURIA-BERTANI-)
MEDIUM
.
25
3.1.2
2XYT-MEDIUM
(SAMBROOK
ET
AL.,
1989)
.
25
3.2
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
P.
VERRUCULOSUM
UND
ANDEREN
PILZEN
.
26
3.2.1
VARIIERTES
MANDELSMEDIUM
1
.26
3.2.2
MEDIUM
FUER
DIE
MYCELANZUCHT
ZUR
PROTOPLASTENGEWINNUNG.
26
3.2.3
MEDIEN
ZUR
STAMMHALTUNG
.
26
3.3
SONSTIGE
MEDIEN
.26
3.3.1
ASSAY-MEDIUM
.
:
.
26
3.3.2
MEDIUM
FUER
KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE
.
26
N
3.3.3
SOC-MEDIUM
.
27
3.4
ANTIBIOTIKA
UND
ANDERE
MEDIENZUSAETZE
.
27
4.
MIKROBIOLOGISCHE,
ZELLBIOLOGISCHE
UND
GENETISCHE
METHODEN
.
27
4.1
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
.
27
4.2
TRUEBUNGSMESSUNGEN
.
28
4.3
STAMMHALTUNG,
KONSERVIERUNG
UND
REINHEITSKONTROLLE
.
28
4.4
KLONIERUNG,
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
.
28
4.4.1
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
.
28
4.4.2
DNA-TRANSFER
IN
E.
COLI
.
29
4.4.3
DNA-TRANSFER
IN
FILAMENTOESE
PILZE
.
29
PROTOPLASTENHERSTELLUNG
.29
ELEKTROPORATION
.
30
4.4.4
SELEKTION
.
30
5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDMETHODEN
.
31
5.1
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
31
5.1.1
DNA
PRAEPARATION
AUS
E.
COLI
.
31
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIRNBOIM
UND
DOLY
(1979)
.
31
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
DEM
WIZARD
PLUS
SPIN
KIT
.
31
5.1.2
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
FILAMENTOESEN
PILZEN
.
32
ISOLIERUNG
NACH
MOELLER
ET
AL.
(1992)
.
32
DNA-ISOLIERUNG
MIT
DNEASY
PLANT
MINI
KIT-SYSTEM
(FA.
QIAGEN)
.
32
5.1.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
33
5.2
REINIGUNG
VON
DNA
.
33
5.2.1
FAELLUNG
VON
DNA
.
33
5.2.2
PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL
EXTRAKTION
.
33
5.3
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNA
.
34
5.3.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
34
5.3.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DNA-FRAGMENTE
.
34
5.3.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
.
.
34
5.3.4
MARKIERUNG
VON
DNA
.
35
5.4
AUFTRENNUNG
UND
NACHWEIS
VON
DNA
.
35
5.4.1
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
35
5.4.2
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
DNA-ELEKTROPHORESE
.
36
5.5
HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE
.
37
5.5.1
TRANSFER
VON
DNA
AUF
MEMBRANEN
(NACH
SOUTHERN,
1975)
.
37
5.5.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
.
37
5.6
POLYMERASE-KETTENREAKTION
-
PCR
.
38
5.6.1
INVERSE
PCR
.
38
5.6.2
KOLONIE-PCR
AUS
E.
COLI
.
39
5.6.3
KOLONIE-PCR
AUS
P.
VERRUCULOSUM
.
39
5.6.4
OLIGONUKLEOTIDE
.
40
M
5.7
DNA-SEQUENZIERUNG
UND
SEQUENZANALYSE
.
41
6.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
42
6.1
PROTEINBESTIMMUNG
.
42
6.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(LAEMMLI,
1970)
.
42
6.3
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BLUE
.
44
6.4
UEBEREXPRESSION
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
.
44
6.5
REINIGUNG
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
.
45
6.6
DNA-PROTEIN-INTERAKTIONSNACHWEIS
DURCH
GEL-SHIFT-ASSAYS
(EMSA)
.
45
III.
ERGEBNISSE
.
47
1.
MOLEKULARE
ANALYSE
EINES
CREA
-HOMOLOGEN
VON
PENICILLIUM
VERRUCULOSUM
.
47
1.1
ERMITTLUNG
DER
GENOMISCHEN
SEQUENZ
VON
CREA
PV
.41
1.1.1
PCR-SCREENING
DER
GENOMISCHEN
DNA
VON
P.
VERRUCULOSUM
MITTELS
PRIMER
VON
CREL
T.
REESEI
.47
1.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
GENOMISCHEN
DNA
VON
P.
VERRUCULOSUM
DURCH
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
.49
1.1.3
KLONIERUNG
EINES
CREA
-HOMOLOGEN
VON
P.
VERRUCULOSUM
MITTELS
SPEZIFISCHER
PRIMER
VON
C-KATABOLITREPRESSOREN
.
50
1.1.4
VERIFIKATION
EINES
PUTATIVEN
CREA
-FRAGMENTS
.
52
1.1.5
KOMPLETTIERUNG
DER
CREXPV-GENSEQUENZ
.
54
1.1.6
VERIFIZIERUNG
DES
ANALYSIERTEN
CREAPV
.GENBEREICHES
.
57
2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
CREAPV-PROTEINS.
61
2.1
KOMPLEMENTATION
DER
CREL'
UND
CREA'
MUTANTEN
MIT
DEM
CREAP
V
-GVN
.
61
2.2
ANALYSEN
DER
CREAPV
-DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
.
63
2.2.1
EXPRESSION
DES
CREAPV-PROTEINS
UND
WEITERER
CREAP-PROTEINE
IN
E.
COLI
.
64
2.2.1.1
KLONIERUNG
DES
CRE4PV-GENS
IN
DEN
VEKTOR
PGEX2T
.
64
2.2.1.2
EXPRESSION
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
.
66
2.2.2
REINIGUNG
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
.
68
2.2.3
PROTEIN-DNA
BINDUNGSSTUDIEN
.
69
2.2.3.1
INTERAKTIONSVERSUCHE
DER
FUSIONSPROTEINE
AN
C-KATABOLITREPRESSIONS
REGULIERTEN
PROMOTOREN
.
69
2.2.3.2
GEL-SHIFT-BINDUNGSSTUDIEN
DER
GST-CREA
FUSIONSPROTEINE
AN
SPEZIFISCHEN
BEREICHEN
VON
CREAP-REGULIERTEN
PROMOTOREN
.
73
3.
,,
KNOCK
OUT"
DES
CREAPV
VON
P.
VERRUCULOSUM
.
78
3.1
STRATEGIE
ZUR
DELETION
GENOMISCHER
BEREICHE
DES
CREAPV-GEAS
.
79
3.2
KLONIERUNG
DER
GENOMISCHEN
FRAGMENTE
IN
DEN
PYES2
-VEKTOR
.
80
3.3
TRANSFORMATION
INP.
VERRUCULOSUM
.
82
3.3.1
KOLONIE-WACHSTUMSOPTIMIERUNG
VON
P.
VERRUCULOSUM
.
82
3.3.2
MEDIUMOPTIMIERUNG
ZUR
SELEKTION
VON
TRANSFORMANTEN
.
83
IV
3.3.3
TRANSFONNATION
DER
DELETIONSKASSETTEN
IN
P.
VERRUCULOSUM
DURCH
ELEKTROPORATION
.
85
3.4
ANALYSE
DER
CR&4PV-DEFIZIENTEN
P.
VERRUCULOSUM
KLONE
.
86
3.4.1
GENOTYPISIERUNG
DER
P.
VERRUCULOSUM
KLONE
.
86
3.4.2
UNTERSUCHUNG
ZUR
PHAENOTYPISCHEN
AUSWIRKUNG
AUF
DIE
CELLULASEBILDUNG.
89
3.4.3
UEBERPRUEFUNG
DER
STABILITAET
DER
TRANSFORMANTEN
.
90
4.
ANALYSE
DER
MNNG/UV
MUTANTE
M28
10
.
91
IV.
DISKUSSION
.
93
1.
ISOLIERUNG
EINER
CREA
-HOMOLOGEN
SEQUENZ
.
93
2.
ANALYSE
DER
CRE/L
V
-GENREGION
.
96
2.1
ANALYSE
DES
ORF
DES
CREJPV-GENS
.
96
2.2
MOLEKULARE
ANALYSE
DER
5'
UND
3
'-BEREICHE
DES
TV'&D/VGENS
.
96
3.
CHARAKTERISIERUNG
DES
VON
CREA
;VKODIERTEN
PROTEINS
.
100
4.
CREAPV
BESITZT
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
WIE
CREAP
UND
CRE
1
P
.
103
5.
AUSWIRKUNG
DER
DELETION
VON
BINDUNGSDOMAENEN
DES
CREA
PV
AUF
DIE
CELLULASEBILDUNG.
.
106
6.
PHAENOTYPISCHE
VERAENDERUNG
DER
MUTANTE
P.
VERRUCULOSUM
M28-10
WIRD
NICHT
DURCH
MUTATIONEN
DES
CRE^/V-GENS
VERURSACHT
.
108
V.
ZUSAMMENFASSUNG
.
HO
VI.
ANHANG
.
112
1.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
112
2.
TABELLEN
UND
TABELLENVERZEICHNIS
.
.115
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
.
118 |
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