Epitope humaner Gliadinantikörper:
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Veröffentlicht: |
2005
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Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 2005 |
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Zöliakie 1
1.2 Das Screening von synthetischen Peptidbibliotheken oder Pepscan 7
1.3 Das Screening von Phagenpeptidbibliotheken oder Phage Display 8
1.4 Aufgabenstellung 15
2. Material und Methoden 16
2.1 Material 16
2.1.1 Seren 16
2.1.2 Synthetische Peptide 17
2.1.3 Lösungen, Puffer, Medi en 17
2.2 Antikörperisolierung über Affinitätschromatographie 20
2.3 Proteinbestimmung 21
2.4 Proteinfällung 21
2.5 Gliadinantikörper-Bestimmung 22
2.6 Endomysiumantikörper-Bestimmung 24
2.7 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 24
2.8 Silberfärbung der Polyacrylamidgele 25
2.9 Immunblot 26
2.9.1 Elektrotransfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf Nitrozellulose-
Membranen 26
2.9.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose (Immunblot) 27
2.10 DNA-Elektrophorese 28
2.11 DNA-Sequenzierung 28
2.12 Lumineszenzassay 29
2.13 Phagenscreening(Phage-Display-Versuche) 30
2.14 Auswertungskriterien 35
2.14.1 Pepscan: Reaktivitätsindex 35
2.14.2 Phage Display: Konsensussequenzen 35
2.14.3 Homologie 36
3. Ergebnisse 37
3.1 Epitop-Untersuchungen mittels Pepscan 37
3.1.1 Sequenzen von Antikörpern erkannter Peptide des a-Gliadins 40
3.1.2 Sequenzen von Antikörpern erkannter Peptide des y-Gliadins 41
3.2 Epitop-Untersuchungen mittels Phage Display 41
3.3 Bestätigungsversuch der Phage-Display-Ergebnisse mit membrangekoppelten
Peptiden 45
4. Diskussion 49
4.1 Pepscan-Untersuchungen 49
4.2 Screening von Phagenpeptidbibliotheken 53
4.3 Bestätigung der PhagotopSequenzen mittels membrangekoppelter synthetischer
Peptide 55
4.4 Definition von Konsensussequenzen 56
4.5 Vergleich der Sequenzen aus Phage Display und Pepscan 57
4.6 Zusammenfasssung der gefundenen Epitope 64
4.7 Pathobiochemische und diagnostische Relevanz 65
5. Zusammenfassung 67
6. Literaturverzeichnis
7. Anhang
7.1 Zusammenstellung der Seren
7.2 Konsensussequenz-Tabellen der Phage-Display-Versuche
7.3 Lage der Konsensussequenzen vom Phage Display in den Gliadin- und Glutenin-
sequenzen
7.4 Reaktivität der synthetischen Peptide aus den Phage-Display-Versuchen mit humanen
Seren
7.5 Lage der Gliadinantikörper-Epitope aus den Peptidversuchen in den Gliadin- und
Gluteninsequenzen
7.6 Ergebnistabellen der Pepscan-Versuche
8. Kopie einer Publikation, die auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit basiert
(Osman, A.A., Günnel, T., Dietl, A., Uhlig, H.H., Amin, M, Fleckenstein, B., Richter,
T., Mothes, T.: B-cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 2000, 121, 248-254)
Verzeichnis von Tabellen und Abbildungen:
Abbildungen:
Abb. 1: Schematische Darstellung von filamentösen Bakteriophagen 10
Abb. 2: Verschiedene Typen von Phage-Display-Bibliotheken 11
Abb. 3: Schemati scher Phagenaufbau 14
Abb. 4: Reaktionsprofil der humanen Immunglobuline über das a-Gliadin 40
Abb. 5: Reaktionsprofil der humanen Immunglobuline über das y-Gliadin 40
Abb. 6: Elektrophoresemuster der gereinigten Immunglobuline nach Silberfärbung 44
Abb. 7: Immunblot der gereinigten Immunglobuline 44
Abb. 8: Epitope vom a-Gliadin, die von Gliadinantikörpern erkannt wurden 52
Abb. 9: Epitope vom y-Gliadin, die von Gliadinantikörpern erkannt wurden 53
Abb. 10: Untersuchung der Dodekapeptide mit PEQ-Sequenzen anhand nach
synthetisierter überlappender Hexapeptide 60
Tabellen:
Tab. 1: Anwendungsgebiete der Phage-Display-Technik 12
Tab. 2: Altersabhängige Referenzbereiche bei den IgA- und IgG-Gliadinantikörper-
Bestimmungen entsprechend des LABMASTER-Tests 24
Tab. 3: Gele für die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese 26
Tab. 4: Vorabsorption und Tweenkonzentration je Panning-Runde (Panning-Ansatz) 31
Tab. 5: Anzahl der erkannten Peptide im Pepscan 39
Tab. 6: Von Gliadinantikörpern erkannte Sequenzen im Pepscan 42
Tab. 7: Charakteristika der Seren für die Phage-Display-Versuche 43
Tab. 8: Gliadinhomologe Teilsequenzen aus den Phage-Display-Versuchen 45
Tab. 9: Reaktionsprofil von Peptiden mit humanen Seren, die unterschiedliche IgG-
Gliadinantikörper-Titer aufweisen 47
Tab. 10: Reaktionsprofil von Peptiden mit humanen Seren, die unterschiedliche IgA-
Gliadinantikörper-Titer aufweisen 48
Tab. 11: Antikörperreaktivität mit zwei Gliadinepitopen und ihren partiell deamidierten
Gegenstücken 61
Tab. 12: Humane Epitope von Gliadinantikörpern 63
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