Identifizierung und Charakterisierung Rac-spezifischer Guaninnukleotid-Austauschfaktoren in menschlichen HL60-Leukämiezellen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Neutrophile Granulozyten 1
1.2 Signaltransduktion 3
1.3 Phospholipase C 6
1.4 Rho GTPasen 8
1.5 GTPase aktivierende Proteine (Rho GAPs) 12
1.6 Rho Guaninnukleotid Dissoziationsinhibitoren (Rho GDIs) 12
1.7 Guaninnukleotid Austauschfaktoren 14
1.8 Ziele der Arbeit 21
2 Material 23
2.1 Chemikalien 23
2.2 Radioaktiv markierte Chemikalien 26
2.3 Enzyme, Kits und Nukleinsäuren 26
2.4 Rezeptorliganden 27
2.5 Verbrauchsmaterial 27
2.6 Säulen und Gele für die Chromatographie 28
2.7 Pro und Eukaryontische Zellstämme 28
2.8 Plasmide 28
2.9 Bereits vorhandenes Konstrukt 29
2.10 Primer zur DNA Sequenzierung und für PCR Analyse 29
2.11 Rekombinantes Protein 30
2.12 Molekulargewichtsstandards für die SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
(SDS PAGE) 30
2.13 Antikörper 31
2.14 Geräte 32
2.15 Elektronische Datenverarbeitungsprogramme 33
3 Methoden 34
3.1 Mikrobiologische Methoden 34
3.2 Molekularbiologische Methoden 37
3.3 Proteinexpression in Bakterien 49
3.4 Eukaryontische Zellkultur 52
3.5 Proteinexpression in Insektenzellen 55
Inhaltsverzeichnis
3.6 Proteinpräparation 57
3.7 Proteinbiochemie 60
3.8 Chromatographische Methoden 69
3.9 Bestimmung der Aktivität der NADPH Oxidase 73
3.10 Messung der intrazellulären Ca2+ Freisetzung an HL60 Zellen 74
3.11 Bestimmung von GTP[S] Bindungstellen 75
3.12 Bestimmung der Phospholipase C Aktivität 79
4 Ergebnisse 84
4.1 Terminale /« v/Yro Differenzierung von HL60 Zellen 84
4.2 Expressionsanalysen von Signaltransduktionsproteinen während der
terminalen Differenzierung in HL60 Zellen 97
4.3 Stimulation der PLCß in partikulären Fraktionen von HL60 Zellen durch
Rac2 121
4.4 Untersuchung der Rho GEF Aktivität von rekombinantem Vavl 126
4.5 Untersuchung des Einflusses von SopE auf den Guaninnukleotidaustausch 132
von monomerem Rac2 und heterodimerem Rac2/Rho GDI
5 Diskussion 152
6 Zusammenfassung 168
7 Literaturverzeichnis 171
8 Publikationen 189
9 Danksagung 190
10 Lebenslauf 191
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