Generierung adenoviraler Vektoren für die experimentelle Tumortherapie mit den Genen für murines Interleukin2 und murines Interleukin12:
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|---|---|
| adam_text | A ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 1
B EINLEITUNG 3
1. Gentherapie 3
1.1 Prinzip der Gentherapie 3
1.2 Zielerkrankungen der Gentherapie 5
2.Gentherapievektoren 8
2.1 .Nicht virale Systeme 8
2.1.1 Physikalische Methoden 8
2.1.2 Chemische Methoden 9
2.2 Virale Systeme 9
2.2.1 Retrovirale Vektorsysteme 9
2.2.2 Herpes Simplex Virus Typ1 (HSV1) als Vektoren 11
2.2.3 Adeno-assziierten Viren (AAV) als Vektoren 11
2.2.4 Adenovirale Vektoren (AdV) 12
2.2.4.1 Biologie von Adenoviren 12
2.2.4.1.1 Struktur von Adenoviren 12
2.2.4.1.2 Genom von Adenoviren 13
2.2.4.1.3 Genprodukte von Adenoviren 14
2.2.4.1.4 Replikationszyklus von Adenoviren 14
2.2.4.2 Evolution adenoviraler Vektorsysteme 16
3. Hintergründe und Ansatzpunkte für eigenes Vorgehen 19
3.1 Ontogenese und Tumorimmunität 19
3.2 Die lokale Immunmodulation mit IL2 und IL12 20
3.2.1 Immunologie von Interleukin 2 (IL2) 21
3.2.2 Immunologie von Interleukin 12 (IL12) 22
4. Zielstellung der eigenen Arbeit 23
C MATERIAL 25
1. Vektoren / Plasmide 25
2. Oligonuleotide (Primer) 25
3. Reagenzsystem für die Herstellung Adenoviraler Vektoren 26
4. Enzyme 26
5. Bakterienstämme 26
6. Eukaryote Zelllinie 26
7. Reagenzsysteme zur Nukleinsäureisolierung / Aufarbeitung 27
8. Reagenzien 27
9. Bakterienmedien 28
10. Zellkulturmedien 29
11. Puffer und Lösungen 29
12. Technische Ausstattung 30
13. Verbrauchsmaterialien 32
D METHODEN 33
1. Arbeiten mit Bakterien 33
1.1 Bakterienkulturen auf Agarplatten 33
1.2 Übemachtkulturen 33
1.3 Glycerinkulturen 33
1.4 Transformation 34
1.4.1. Chemische Transformation 34
-III-
1.4.2 Chemische Transformation als QUICK-Transformation 34
1.4.3 Elektroporation 34
1.5 Vervielfältigung elektrokompetenter Bakterien für Transformation 35
1.6 Plasmid-Isolation aus Bakterien 36
2. Arbeiten mit eukaryotischen Zellen 37
2.1 Kultivierung 37
2.2 Zellzahlbestimmung 37
2.3 Mykoplasmentest 38
2.4 Transfektion 38
2.5 Präparation von Virusstocks aus Produktionszelllinien 39
2.6 Infektion 39
3. Molekularbiologische Methoden 39
3.1 Restriktionsverdau 39
3.2 Dephosphorylierung von DNA-Enden 40
3.3 DNA-Klonierung 40
3.4 Elektrophorese 41
3.5 DNA-Isolierung aus Elektrophoresegelen 42
3.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 42
3.7 PCR 42
3.7.1 Real-TimePCR 43
3.7.2 Nested PCR 44
3.8 Sequenzierung 45
3.9 Isopropanol-Präzipitation 46
3.10 Ethanol-Präzipitation 47
3.11 Phenol-Chloroform-Extraktion 47
E ERGEBNISSE 48
1. Überblick über das verwendete adenovirale Vektorsystem AdEasy™ 48
2. Isolierung der Transgenkassetten für mlL2 und mlL12 aus ihren
Ursprungsplasmiden 50
3. Klonierung der Transgenkassetten für mlL2 und mlL12 in den Transfervektor
des AdEasy™ Systems 53
3.1 Doppelverdau des Transfervektors pShuttleCMV 53
3.2 Ligation der Transgenkassetten in den pShuttleCMV 54
3.3 Kontrolle der Klonierung durch Restriktionsverdau 55
3.4 Anlegen von Glycerinkulturen der positiven Klone 55
3.5 Vermehrung eines positven Klones für mlL2 und mlL12 in Bakterien 55
3.6 Kontrolle der Klonierung durch Sequenzierung 56
4. Homologe Rekombination des adenoviralen Rückratvektors pAdEasy mit den
Transfervektoren für mlL2 und mlL12 in Bakterien 57
4.1 Linearisierung und Dephosphorylierung der Enden der beiden
Transfervektoren für mlL2 und mlL12 58
4.2 Transformation der vorbereiteten Transfervektoren für mlL2 und mlL12 in
den Bakterienstamm BJ5183-AD1 59
4.3 DNA Isolation ausgewählter Rekombinanten für mlL2 und mlL12 61
4.4 Überprüfung der Rekombinanten durch Real Time PCR und Anlegen von
Glycerinkulturen 63
5. Darstellung der fertigen adenoviralen rekombinanten Plasmide im
Computerprogramm Vector NTI 66
6. Transformation der fertigen adenoviralen Rekombinanten für mlL2 und mlL12
in den stabilen Bakterienstamm DH5a 66
-IV-
7. Präparation ausreichender DNA Mengen der adenoviralen Rekombinanten für
mlL2undmlL12 67
8. Linearisierung der mlt_2 und mlL12 Rekombinanten vor der Transfektion 68
9. Transfektion der linearisierten adenoviralen Rekombinanten für mlL2 und
mlL12 in die Produktionszelllinie HEK293A 69
10. Transfektionskontrolle 71
11. Anlage primärer Virusstocks 72
12. Infektion der Produktionszelllinie HEK293A mit primärem Virusstock 72
13. PCR vermittelter Adenovirusnachweis in den infizierten Zellen 73
14. Co-Transfektion in die Produktionszelllinie HEK293A mit dem adenoviralen
Rückgratvektor pAdEasy und den beiden linearisierten Transfervektoren für
mlL2undmlL12 75
F DISKUSSION 76
G LITERATURVERZEICHNIS 86
Anhang
-V-
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