Charakterisierung des murinen Anionenaustauschers Ae4 (Slc4a9):
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2004
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| adam_text | Titel: Charakterisierung des murinen Anionenaustauschers Ae4 (Slc4a9)
Autor: Celebcioglu, Suna
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 7
1.1 Physiologie und Pathophysiologie der renalen pH-Regulation 8
1.1.1 Aufbau der Niere und ihre Rolle in der pH-regulation 8
1.1.2 Rolle des proximalen Tubulus der Niere in der pH-Regulation 9
1.1.3 Bicarbonat-Rückresorption im kortikalen Sammelrohr 10
1.2. Die £LC44-Genfamilie 12
1.2.1 Die AE1-3 (SLC4A1-3) 15
1.2.2 Der AE4 (SLC4A9) 17
1.3 Ziele der Arbeit 20
2. Material und Methoden 21
2.1 Puffer, Lösungen und Medien 21
2.2 Molekularbiologische Methoden 26
2.2.1 Herstellen von kompetenten Bakterien 26
2.2.2 Transformation kompetenter Bakterien 26
2.2.3 Minipräparation von Plasmid-DNS aus Bakterien 27
2.2.4 Maxipräparation 27
2.2.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 27
2.2.6 Restriktionsverdau von Nukleinsäuren 28
2.2.7 Dephosphorylierung von DNS-Enden 28
2.2.8 Phenolisieren 28
2.2.9 Auftrennung und Isolierung von DNS-Fragmenten 29
2.2.10 Ligation von DNS-Fragmenten in Plasmide 29
2.2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 30
2.2.12 Isolierung von genomischer DNS aus Gewebe 30
2.2.13 RNS-Isolierung aus Organgewebe der Maus 31
2.2.14 Northern blot 32
2.2.15 Hybridisierung der Blotmembran 33
2.2.16 Southern blot 34
2.2.17 5 -RACE 35
2.2.17.1 Einführung und Prinzip der Methode 35
2.2.17.2 Durchführung der 5 JRACE-PCR 35
2.2.18 3 -RACE 36
3
2.2.18.1 Durchführung der 3 -RACE 36
2.3 Zellkulturtechniken 36
2.3.1 Verwendete Zelllinien 36
2.3.1.1 HEK-293(ATCCCRL-1573) 36
2.3.1.2 NIH-3T3(ATCCCRL-1658) 37
2.3.2 Transfektion von Säugetierzellen durch Lipofektion 37
2.3.2.1 Einfuhrung und Prinzip der Methode 37
2.3.2.2 Durchführung 37
2.3.3 Luciferase Messung 38
2.3.4 ß-Galaktosidase (ß-Gal) Messung 38
2.3.5 Lysierung von Zellen 39
2.4 Proteinbiochemische Methoden 39
2.4.1 Membranpräparation 39
2.4.1.1 Durchfuhrung 39
2.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 40
2.4.3 Herstellung von Antikörpern 41
2.4.3.1 Antikörpergewinnung 41
2.4.3.2 Antikörperaufreinigung 41
2.4.4 Western blot 42
2.5 Analyse der transgenen Maus 44
2.5.1 Fixierung der Mäuse vor Präparation 44
2.5.2 Anfertigung von Vibratomschnitten der Organe 44
2.5.3 X-Gal Färbung von Organpräparaten 45
3. Ergebnisse 46
3.1 Isolierung der Volllänge cDNS für Ae4 aus der Maus 46
3.2 Der murine Ae4 wird spezifisch in der Niere exprimiert 48
3.3 Ein spezifischer Antikörper gegen zwei Peptide des VL Ae4
wurde generiert 50
3.4 Analyse der 3 - und 5 -Regionen des Ae4 52
3.4.1 Die 3 -Region der Exons 19-21 des Ae4 im 3 -RLM-RACE 52
3.4.2 Die 5^-Region der Exons 1-8 des Ae4 im 5^-RLM-RACE 54
3.5 Klonierung der Promotorkonstrukte 57
3.6 Promotoraktivität der 5-Konstrukte in der Zellkultur 60
3.7 Generierung einer transgenen Maus 62
4
3.7.1 Injektion von promHl 65
3.7.2 Vier von 37 Mäusen sind transgen 65
3.7.2.1 Identifizierung der transgenen Tiere mittels PCR 65
3.7.2.2 Identifizierung der transgenen Tiere mittels Southern
blot 66
3.8 Analyse der transgenen Maus 68
3.8.1 PromHl zeigt starke Promotoraktivität in der Niere der
transgenen Maus 68
3.8.2 ß-Galaktosidase wird spezifisch in der Niere exprimiert 71
3.8.3 PromHl zeigt in anderen Organen keine Aktivität 72
4. Diskussion 74
4.1 Die Expression von Ae4 erfolgt spezifisch in der Niere 74
4.1.1 Ist AE4 der apikale QTHCCV-Austauscher in ß-inter-
kalierenden Zellen? 76
4.2 Ae4 wird alternativ transkribiert 78
4.2.1 Welche Eigenschaften des AE4 vermittelt der N-terminale
Schwanz? 81
4.2.2 Beeeinflußt der N-Terminus sorting bzw. targeting Prozesse? 84
4.3 Identifizierung der regulären und alternativen Promotoren
V0UiAe4 85
4.3.1 Methoden zur Analyse von Promotoraktivität 86
4.4 Alle Promotoren zeigen Aktivität in der Zellkultur 88
4.5 Die transgene Maus 90
4.6 Ausblick 94
5. Zusammenfassung 95
6. Literaturverzeichnis 97
6.1 Originalartikel 97
6.2 Bücher 109
7. Anhang 110
7.1 Abkürzungen 110
7.2 Verwendete Oligonucleotide 111
73 Klonierungen 114
7.4 Danksagung 116
5
7.5 Lebenslauf 118
7.6 Erklärung nach §4 der Promotionsordnung 119
6
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