Die Expression und nukleäre Aktivität der Rel/NF-kB-Transkriptionsfaktoren [Rel/NF-kappaB-Transkriptionsfaktoren] in Hodgkin- und anderen hämatopoetischen Zellinien:
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Seite
Abkürzungen IV
1 Einleitung 1
1.1 Klinik und Pathogcncsc des Morbus Hodgkin 1
1.1.1 Klinische Symptomatik 1
1.1.2 Das histologischc Bild 2
1.1.3 Ätiologic und Pathogcncsc des Morbus Hodgkin 3
1.1.3.1 Klonalität und zellulärer Ursprung der Hodgkin- und Rccd-Stcrnbcrg-Zcllcn 3
1.1.3.2 EBV-Infcktion und Morbus Hodgkin 5
1.1.3.3 Charakteristika von Hodgkin- und Rccd-Stcrnbcrg-Zcllcn 6
1.1.3.3.1 Die Expression von Proteinen der TNF/TNFR-Familic 8
1.1.3.3.2 Die Expression von Zytokinen 9
1.2 Die Kontrolle der Genexpression durch Rcl/ NF-KB-Transkriptionsfaktorcn 13
1.2.1 Transkriptionsfaktoren und regulatorische DNA-Scqucnzcn 13
1.2.2 Die Rcl/NF-KB/lKB-Familic 13
1.2.2.1 Die Mitglieder der Familie und deren Komplcxbildung 15
1.2.2.2 Die Regulation der NF-KB-Translokation in den Zellkern 17
1.2.2.3 NF-kB und das Immunsystem 20
1.2.2.3.1 NF-kB als Vermittler inflammatorischcr Prozesse 20
1.2.2.3.2 Die Bedeutung von NF-kB für die Aktivierung und Differenzierung
von B und T-Lymphozyten 21
1.2.2.4 Das onkogene Potential von Rcl/NF-KB-Faktorcn 22
2 Zielsetzung 26
3 Material und Methoden 27
3.1 Chemikalien, Enzyme und Antikörper 27
3.2 Zcllkultur 27
3.2.1 Verwendete Zellen und Zellinicn 27
3.2.2 Zcllkulturbcdingungcn 29
3.2.3 Kryokonscrvicrung und Auftauen der Zellinicn 29
3.2.4 Passagieren von Zellen 30
3.3 RNA-Extraktion mittels CsCI-Gradicntcn 31
3.3.1 Aufschluß der Zellen 31
3.3.2 Der CsCl-Gadicnt 32
3.3.3 Fällung der RNA 32
3.4 Amplifikation von Plasmid-DNA 33
3.4.1 Baktcricnkultur 33
3.4.2 Herstellung kompetenter Bakterien 34
I
3.4.3 Transformation der Bakterien und Anzucht 35
3.5 Präparation der Plasmid-DNA 35
3.5.1 Mini-Präparation nach der Phenol-Chloroform-Mcthodc 35
3.5.2 Maxi-Präparation mit Quiagcn 36
3.5.3 Kontroll verdau mit Restriktionsendonuklcascn 37
3.6 Elcktrophoretischc Methoden 38
3.6.1 Herstellung eines Agaroscgels 38
3.6.2 Auftrennung der Proben 38
3.7 Elcktroclution von DNA-Fragmenten aus einem Agaroscgcl 39
3.7.1 Eluicrung nach Qiuacx 39
3.8 Northcrn-Blot-Analyse 40
3.8.1 Markierung der DNA-Fragmente 41
3.8.2 Auftrennung der RNA mittels Elektrophorese 42
3.8.2.1 Vorbereitung von Gel und RNA 42
3.8.2.2 Gclclektrophoresc und Transfer auf den Filter 43
3.8.3 Prähybridisicrung und Hybridisierung 43
3.8.4 Autoradiographie und Auswertung 44
3.9 Wcstcm-Blot-Analyse 44
3.9.1 Quantifizierung der Proteine nach Bradford 45
3.9.2 SDS-Polyacrylamid-Elcktrophoresc nach Laemmli 45
3.9.3 Wcstern-Blotting 46
3.10 Präparation von Zcllkcrncxtrakten 47
3.10.1 Präparation von „Maxi-Extrakten 47
3.10.1.1 Vorbereitung der Zellen 48
3.10.1.2 Präparation von Kern-und Zytoplasmaextraktcn 48
3.10.2 Präparation von „Mini-Extrakten 49
3.11 Gclrctcntionsanalysc 49
3.11.1 Verwendete Oligonuklcotidc 50
3.11.2 :P-Endmarkierung der Oligonuklcotidc 50
3.11.3 Herstellung des Gels 51
3.11.4 Vorbereitung der Proben 51
3.11.5 Elektrophorese, Trocknung des Gels und Autoradiografic 51
3.11.6 Supcrshift 52
4 Ergebnisse 53
4.1 Die DNA-Bindungsaktivität der RcI/NF-KB-Transkriptionsfaktorcn 53
4.1.1 Die nukleare NF-icB-Aktivität in B-lymphatischcn Zcllinien 54
4.1.2 Die nukleare NF-icB-Aktivität in T-lymphatischcn und myelomonozytären
Zcllinien 56
II
4.1.3 Die nukleare NF-KB-Aktivität in cpithclialcn Zcllinicn 57
4.1.4 Die DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors NF-kB in
Hodgkin-Zcllinicn und primären H/RS-Zcllcn 58
4.1.5 Die Wirkung von PDTC auf die nukleare Aktivität von NF-KB in
Hodgkin-Zellinicn 62
4.2 Untersuchung der Zusammensetzung der Rcl/NF-KB-Komplcxc
mit Antisercn/Antikörpcrn (Supcrshift) 63
4.2.1 Supcrshift-Analysc mit Kernextrakten aus reifen B-lymphatischcn Zcllinicn 64
4.2.2 Supcrshift-Analyse mit Kernextrakten aus Hodgkin-Zcllinicn und primären
H/RS-Zcllcn 67
4.3 Untersuchung der Expression von Mitgliedern der NF-KB/Rel/lKB-Familic
auf mRNA-und Protein-Ebcnc 75
4.3.1 Die Expression von NF-KB/Rcl-Faktorcn 75
4.3.2 Die Expression des Inhibitorprotcins IkB-u 75
4.3.3 Untersuchung der lKB-a-Exprcssion auf Proteinebene 77
5 Diskussion 78
5.1 Hodgkin- und Rccd-Stcrnbcrg-Zcllcn - Zellen mit konstitutiver nuklearer
NF-KB-Aktivität 79
5.1.1 Der konstitutive Rel/NF-KB-Komplcx in Hodgkin-Zcllinicn setzt sich
vorrangig aus p50/p65-Hctcrodimcrcn zusammen 80
5.1.2 Der Einfluß von PDTC auf die konstitutive NF-KB-Aktivität 82
5.2 Die Bedeutung von NF-kB für Proiifcration und Apoptoscrcsistcnz von
Hodgkin- und Rccd-Stcrnbcrg Zellen 83
5.2.2 Die Bedeutung einer konstitutiven Expression proinflammatorischcr Gene 83
5.2.3 NF-kB als Simulator der Proliferation 84
5.2.4 NF-kB als Apoptoscinhibitor 85
5.2.5 Konstitutive NF-KB-Aktivität und Selektion in den Follikclzcntrcn 86
5.3 Mögliche Mechanismen der NF-KB-Dercgulation in H/RS-Zcllcn 88
5.3.1 Die Induktion von NF-kB durch cxtrazellulärc Signale und Viren 88
5.3.2 Die Kontrolle der NF-KB-Aktivität in H/RS-Zcllcn durch IkB-u 90
5.4 Vor- und Nachteile der Untersuchung immortalisicrter Hodgkin-Zcllinicn 93
6 Zusammenfassung 94
Literaturverzeichnis 96
Danksagung 120
Eidesstattliche Erklärung 120
Lebenslauf 121
III
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