Untersuchung der TGF-beta und IGF-1 mRNA-Expression in akuten und chronischen Wunden:
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2005
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Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Physiologie der Wundheilung 1
1.2 Wachstumsfaktoren und Wundheilung 4
1.3 Transforming Growth Factor-ß 5
1.3.1 Struktur und Eigenschatten 5
1.3.2 Vorkommen in vivo, Expressionsmuster in vitro 5
1.3.3 Biologische Aktivität 5
1.3.4 TGF-ß und Wundheilung 6
1.4 Insulin-like Growth Factor 7
1.4.1 Struktur und Eigenschaften 7
1.4.2 Vorkommen in vivo, Expressionsmuster in vitro 7
1.4.3 Biologische Aktivität 7
1.4.4 IGF-1 und Wundheilung 8
1.5 Fragestellung 9
2 MATERIAL UND METHODEN 10
2.1 Grundlegende Techniken 10
2.1.1 Allgemeine Kontaminationsprävention 10
2.1.2 Fällung von Nukleinsäuren 10
2.1.3 Messungen am Spektralphotometer 10
2.1.4 Computerprogramme 11
2.1.5 Spezielle PCR-Kontaminationsprävention 12
2.2 Untersuchungsmaterial Stanzbiopsien 12
2.2.1 Patientenkollektiv 12
2.2.2 Behandlungsschema und Entnahmeprotokoll 14
2.2.3 Entnahmetechnik und Lagerung 14
2.2.4 Homogenisierung der Probe am Kryotom 15
2.2.5 HE-KontroHfärbung 15
2.3 Extraktion der Gesamt-RNA 1 $
2.3.1 Zellyse, Elution und Vermessung 16
2.3.2 DNaseverdau der extrahierten Gesamt-RNA 17
2.3.3 Qualitätskontrolle der RNA im Formaldehydgel 17
2.4 Synthese und Weiterverarbeitung der cDNA 18
2.4.1 Die Reverse Transkription 18
2.4.2 Aufreinigung der transkribierten cDNA 19
2.4.3 KontroK-PCR der cDNA 19
2.5 Wachstumsfaktor-PCRs 20
2.5.1 PCR-ProfNe 20
2.5.2 Primer-und Sondensequenzen 20
2.5.3 Synthese des homologen externen Standards 26
2.5.4 Durchführung der PCRs _26
2.5.5 Qualitative PCR _26
2.6 Analyse der RT-PCR-Amplffikate 27
2.8.1 TAE-GeteleMrophorese 27
2.6.2 Southern Blotting _27
2.6.3 Slot-Blot 28
2.6.4 Speamatsnachweis durch Hybridisierung _28
2.6.5 Chemoluminiszenz-Detektion von PCR-Ampiifikaten 29
3 ERGEBNISSE 30
3.1 Vakuumversiegelungstechnik . 30
3.2 Laborparameter 31
3.3 Infiltration nach HE-Färbung _31
3.4 Gesamt-RNA M
3.4.1 Photometrische Qualitätskontrolle der Gesamt-RNA 34
3.4.2 Qualitätskontrolle der Gesamt-RNA im Agarosegel 34
3.4.3 RNA-Mengen im Behandlungszertraum 35
3.4.4 RMA und Infiltration 35
3.5 cDNA 36
3.5.1 Qualitätskontrolle der cDNA 36
3.5.2 cONA-Mengen im Behandlungszertraum 36
3.5.3 cDNA und Infiltration 37
3.5.4 Korrelation cDNA und RNA 37
3.6 Homologe externe Zytokinstandards M
3.6.1 SensitivitätderStandard-PCRs M
3.6.2 Spezifität der Standard-PCRs 38
3.7 Qualitative Vorscreen-PCR 39
3.7.1 TGF-8,-Expression. . _39
3.7.2 Zusammenhang TGF-ß,-Expression mit Infiltration, RNA und cDNA _40
3.7.3 TGF-ßrExpression, . _40
3.7.4 Zusammenhang TGF-ßa-Expression mit Infiltration, RNA und cDNA _42
3.7.5 TGF-ß Rll-Expression . 42
3.7.6 Zusammenhang TGF-ß-RII-Expression mit Infiltration, RNA, cDNA _*2
3.7.7 Zusammenhänge der Expression der einzelnen Komponenten des TGF-ß-Systems 43
3.7.8 IGF-1-Expression 43
3.7.9 IGF-1 R-Expression **
3.7.10 Spezifflatsnachweis der Expressionssignale _45
4 DISKUSSION 46
4.1 TGF-_,-mRNA-_xpression in klinischen Proben ___46
4.2 TGF-Rj-Expression in klinischen Proben _—-50
4.3 TGF-_-RM-Expression in klinischen Proben ___s1
4.4 IGF-1- und IGF-R1-mRNA-Expression in klinischen Proben 63
5 ZUSAMMENFASSUNG 5$
6 LITERATURVERZEICHNIS 58
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Datenblatt zur TGF-ß,-PCR 21
Abbildung 2: Datenblatt zur TGF-ß3-PCR 22
Abbildung 3: Datenblatt zur TGF-ß-RII-PCR 23
Abbildung 4: Datenblatt zur IGF-1-PCR 24
Abbildung 5: Datenblatt zur IGF-1R-PCR 25
Abbildung 6: Wundverschluß mit Vakuumversiegelungstechnik 30
Abbildung 7: Zelluläre Infiltration Im Behandlungszeitraum (HE-Färbung) 32
Abbildung 8: Zelluläre Infiltration in der HE-Färbung 33
Abbildung 9: Qualitätskontrolle der RNA im 1 % Agarosegel 34
Abbildung 10: Gesamt-RNA im Behandlungszeitraum 35
Abbildung 11: Qualitätskontrolle der cDNA in der HLA-PCR 36
Abbildung 12: Korrelation Gesamt-RNA und cDNA 37
Abbildung 13: Überprüfung der Sensitivität der Standard-PCRs 38
Abbildung 14: Relative Intensität der TGF-ß^mRNA-Expression 40
Abbildung 15: Relative Intensität der TGF-ßa-mRNA-Expression 41
Abbildung 16. Dot blot TGF-^-Verdünnungsreihen 45
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht Patientenkollektiv 13
Tabelle 2: PCR-Temperaturprofile 20
Tabelle 3: Infiltrationsgrad nach HE-Färbung 31
Tabelle 4: Übersicht qualitative Vorscreen-PCRs 39
Tabelle 5: Expressionsübersicht TGF-ß, 39
Tabelle 6: Expressionsübersicht TGF-Ü3 41
Tabelle 7: Expressionsübersicht TGF-ß-RII 42
Tabelle 8: Relative Intensität der TGF-ß-mRNA-Expression 43
Tabelle 9: Expressionsübersicht IGF-1 44
Tabelle 9: Expressionsübersicht IGF-1 R 44
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