Identifizierung und Charakterisierung von Tetracyclin-RNA-Interaktionen in E. coli:
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2005
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Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung V
1 Einleitung 1
1.1 Tetracycline 1
1.1.1 Entdeckung und Entwicklung der Tetracycline 1
1.1.2 Glycylcycline 3
1.1.3 Wirkungsweise von Tetracyclin 4
1.2 Tetracyclin-Resistenzen 8
1.2.1 Ribosomale Schutzproteine 8
1.2.2 Regulation von Tetracyclin-Resistenzen 11
1.3 Fragestellung 13
1.3.1 Vergleich der Bindestellen und des antibiotischen Wirkmechanismus
von Tetracyclin und Tigecyclin 13
1.3.2 Regulation von tetO 14
2 Material und Methoden 15
2.1 Materialien 15
2.1.1 Chemikalien 15
2.1.2 Hilfsmittel 19
2.1.3 Geräte 20
2.1.4 Reagenziensätze 21
I
II INHALTSVERZEICHNIS
2.1.5 Enzyme und Proteine 22
2.1.6 Oligonukleotide 23
2.2 Bakterienstämme 26
2.3 Plasmide 27
2.4 Puffer und Medien 28
2.4.1 Allgemeine Puffer und Lösungen 28
2.4.2 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese 29
2.4.3 Bakteriennährmedien 31
2.5 Methoden 33
2.5.1 Allgemeine Methoden 33
2.5.2 Anzucht von Bakterien 33
2.5.3 Transformation von E. coli 34
2.5.4 DNA-Gelelektrophorese 34
2.5.5 Methoden mit Nukleinsäuren 36
2.5.6 Protein-Gelelektrophorese 39
2.5.7 Bestimmung der minimal inhibitorischen Konzentration
von Tetracyclin und Tigecyclin 39
2.5.8 Aufreinigung von TetO 40
2.5.9 Isolation von Ribosomen 40
2.5.10 Chemische Modifikation von 70S Ribosomen 46
2.5.11 Fenton-Spaltung eines Tetracyclin-bindenden Aptamers 53
2.5.12 Bestimmung der /3-Galaktosidase-Aktivität in E. coli 54
2.5.13 In tntro-Transkription 56
2.5.14 TetO abhängige Verzögerung der RNA-Mobilität 57
2.5.15 Strukturüberlagerung 57
3 Ergebnisse 58
3.1 Vergleich der rRNA-Interaktionen von Tetracyclin und Tigecyclin 58
INHALTSVERZEICHNIS III
3.1.1 Resistenzanalyse 58
3.1.2 DMS-Modifikation der 16S rRNA 68
3.1.3 Fenton-Spaltung der 16S rRNA 71
3.2 Fenton-Spaltung eines Tetracyclin-bindenden Aptamers 83
3.3 Expressionsregulation des ribosomalen Schutzproteins TetO 84
3.3.1 Klonierung von pWH230 86
3.3.2 Tetracyclin-abhängige Expression von tetOup-lacZ 88
3.3.3 Eingrenzung des regulatorisch aktiven Bereichs in tetOup 89
3.3.4 Mutagenese des alternativen Startkodons in tetOup 96
3.3.5 Einfluß verschiedener Tetracyclin-Derivate auf die Expression von
tetOup-lacZ 98
3.3.6 Unspezifischer Effekt von Tetracyclin auf die JacZ-Expression . 99
3.3.7 Einfluß von TetO auf die Regulation von tetOup-lacZ 100
3.3.8 TetO-unabhängige Tetracyclin-Regulation von tetOup-lacZ 102
3.3.9 Einfluß von TetO auf Stämme mit tetOup-lacZ-Fusionen 103
3.3.10 Einfluß von TetO auf die Elektromobilität der tetOup-RNA 106
4 Diskussion 109
4.1 Vergleich der rRNA-Interaktionen von Tetracyclin und Tigecyclin 109
4.1.1 Fenton-Spaltung von RNA 109
4.1.2 Fenton-Spaltung der 16S rRNA 112
4.1.3 Orientierung von Tigecyclin in Tet-1 und Tet-4 116
4.1.4 Vergleich der Wirkungsweise von Tetracyclin und Tigecyclin . 118
4.1.5 Ausblick 119
4.2 Expressionsregulation des ribosomalen Schutzproteins TetO 119
4.2.1 Riboswitch vermittelte Regulation 120
4.2.2 Regulation durch Attenuation 124
4.2.3 Autoregulation durch TetO 125
IV INHALTSVERZEICHNIS
4.2.4 Modell zur Regulation von tetO 127
4.2.5 Ausblick 128
5 Literaturverzeichnis 129
Abkürzungsverzeichnis 138 |
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