Entwicklung und Evaluierung neuer Nachweissysteme für Enteroviren zur Abklärung klinischer und epidemiologischer Fragestellungen:
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1. Einleitung 1
Humane Enteroviren 1
Viruseigenschaften und Virusaufbau 1
Phylogenetische Einteilung der Enteroviren 3
Allgemeine Epidemiologie der Enteroviren 5
Klinische Aspekte der Enterovirusinfektionen 6
Diagnostik der Enterovirusinfektionen 7
Ziele der Arbeit 8
2. Material 11
3. Methoden 27
3.1 Viruskultivierung und -phänotypisierung 27
3.2 Molekularbiologie 28
3.3 Proteinbiochemie 36
4. Ergebnisse 45
4.1 Entwicklung eines Antigen-ELISA zum Nachweis von
Enteroviren in Stuhlproben 45
4.1.1 Immunisierung mit aufgereinigtem Enterovirus 45
4.1.2 Immunisierung mit aus SDS-PAGE gereinigtem VP1 48
4.1.3 Herstellung von rekombinantem Protein zur Immunisierung 49
4.1.4 Genetische Immunisierung 51
4.1.5 Spezifitätsaustestungen geeigneter Seren und monoklonaler Antikörper 55
4.1.7 Auswahl der besten Antikörperkombination für die Detektion von Antigen 58
4.1.8 Austestungen gespikter Stuhlproben im ELISA 59
4.1.9 Austestung klinischer Proben im ELISA 61
4.1.10 Quantifizierung der Viruspartikel in Stuhl-, Liquor- und Rachenabstrichproben.. 62
4.1.11 Magnetpartikel-ELISA 64
4.2 Cluster-spezifischer Nachweis zur molekularen Typisierung
von Enteroviren mittels RT-PCR 65
4.2.1 Spezifitätsaustestung des PCR-Systems innerhalb des Enterovirus-Genus 66
4.2.2 Spezifitätsaustestung anhand von enterovirus-negativen Proben 69
4.2.3 Sensitivitätsaustestung der neuen RT-PCR im Vergleich zu
konventionellen PCR-Systemen 70
5. Diskussion 72
5.1.1 Vorteile eines Enterovirus-Nachweissystems im ELISA-Format 72
5.1.2 Herstellung von spezifischen, hoch-affinen und hoch-aviden Antikörpern 73
5.1.3 Aufbau eines Antigen-ELISA zum Nachweis von Enteroviren 76
5.2.1 Nachweis von Enteroviren in klinischem Probenmaterial mittels RT-PCR 79
5.2.2 VP1 als Targetsequenz zur molekularen Typisierung von Enteroviren 80
5.2.3 Entwicklung einer RT-PCR zur Bestimmung des genetischen
Clusters mit folgender Serotypisierung mittels Sequenzierung 82
6. Zusammenfassung 86
7. Literaturverzeichnis 87
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