Produktion von NGF, BDNF und NT-3, deren rezeptorvermittelte Wirkung in eosinophilen Granulozyten: Bedeutung beim Asthma bronchiale
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1 EINLEITUNG 5
1.1 Der eosinophile Granulozyt 5
1.1.1 Geschichte 5
1.1.2 Herkunft und Morphologie 5
1.1.2.1 Morphologie/Eosinopoese 5
1.1.2.2 Intrazelluläre Bestandteile 7
1.1.2.3 Oberflächenrezeptoren bei eosinophilen Granulozyten 9
1.1.2.4 Funktionen des eosinophilen Granulozyten 10
1.1.2.5 Eosinophilenaktivierung 11
1.1.2.5.1 Transduktionsweg 12
1.1.2.6 Erkrankungen mit eosinophiler Beteiligung 13
1.2 Allergie und Asthma 14
1.2.1 Pathogenese der Allergie 14
1.2.1.1 Zelluläre Beteiligung 15
1.2.2 Asthmapathogenese 15
1.2.2.1 Allgemeines und Einteilung 15
1.2.2.2 Zelluläre Beteiligung 16
1.2.3 Asthma und neurogene Entzündung 16
1.2.4 Eosinophile und die allergische Reaktion 17
1.3 Neurotrophine 18
1.3.1 Vorkommen und Wirkungen 18
1.3.1.1 NGF 19
1.3.1.2 BDNF 21
1.3.1.3 NT 3 22
1.3.2 Neurotrophinrezeptor 23
1.3.2.1 Einteilung und Signalvermittlung 23
1.3.2.1.1 Einteilung 23
1.3.2.1.2 Signaltransduktion 24
1.3.2.1.3 Expression 24
1.3.3 Neurotrophine und Allergie/Asthma 25
1.3.4 Neurotrophine und neurogene Entzündung 26
1.3.5 Neurotrophine und eosinophile Granulozyten 27
2 ZIELSETZUNG 27
2
3 MATERIAL UND METHODEN 29
3.1 Patienten 29
3.2 Zellseparation 29
3.2.1 Granulozytengewinnung 29
3.2.2 Magnetic Beads 30
3.2.3 Zellzahlbestimmung 31
3.2.4 Reinheit 31
3.2.5 Viabilität 32
3.3 Western blot 33
3.3.1 Probenvorbereitung 33
3.3.1.1 Lysatgewinnung 33
3.3.1.2 Proteinbestimmung 34
3.3.2 Nachweis von NGF, BDNF und NT 3 im Zelllysat 35
3.3.3 Nachweis der TrkA, TrkB, TrkC im Zelllysat 36
3.3.4 Nachweis der Rezeptorphosphorylierung 37
3.3.4.1 Immunpräzipitation 37
3.4 RT PCR 38
3.4.1 RNA Isolation und reverse Transkription 38
3.4.2 Polymerase Ketten Reaktion und Auftrennung der DNA 39
3.4.2.1 Primer 40
3.4.3 Nachweis der Neurotrophine NGF, BDNF, NT 3 und der Rezeptoren TrkA, B, C 40
3.5 DURCHFLUßZYTOMETRIE 41
3.5.1 Viabilitätsbestimmung 41
3.5.2 Bestimmung der Reinheit 42
3.5.3 Intrazellulärer Nachweis der Neurotrophine NGF, BDNF, NT 3 43
3.5.4 Nachweis der Rezeptoren TrkA, TrkB und TrkC 44
3.6 Enzyme linked immuno sorbent assay(ELISA) 44
3.7 Zellkultivierung und Stimulation 47
3.7.1 Zellvorbereitung für Viabilitätsbestimmung und Neurotrophinfreisetzung 47
3.7.2 Zellvorbereitung für Rezeptorphosphorylierung 48
3.8 Intrazelluläre Calcium Freisetzung 48
3.8.1 Grundlagen 48
3
3.8.2 Durchführung 48
3.9 Statistische Auswertung 49
4 ERGEBNISSE 50
4.1 Expression der Rezeptoren TrkA, TrkB, TrkC auf eosinophilen Granulozyten 50
4.1.1 Western blot 50
4.1.2 PCR 51
4.1.3 Durchflußzytometrie 52
4.2 Produktion der Neurotrophine NGF, BDNF und NT 3 in den eosinophilen Granulozyten . 54
4.2.1 Western blot 54
4.2.2 PCR 55
4.2.3 Nachweis in der Durchflußzytometrie 55
4.2.4 Neurotrophinnachweis im Eosinophilen Lysat 57
4.3 neurotrophinfreisetzung aus eosinophilen granulozyten 59
4.4 Neurotrophininteraktion 60
4.4.1 Rezeptorphosphorylierung 60
4.4.2 Calciuminflux 61
4.4.3 Viabilität 62
4.4.4 Einfluß der Neurotrophine auf Zytokinfreisetzung 63
4.4.4.1 IL 4 , IL 5 , IL 8 und TGF ß1 Freisetzung 63
4.4.4.2 ECP und EPX Freisetzung 64
5 DISKUSSION 66
5.1 Hauptergebnisse 66
5.2 Diskussion der Ergebnisse 66
5.3 Immunologische Bedeutung der Ergebnisse 74
5.4 Bedeutung der Ergebnisse für die neurogene Entzündung 78
5.5 Neurotrophine in Allergie und Asthma 82
5.6 Ausblick 84
5.7 Zusammenfassung 86
4
6 REFERENZEN 88
7 ANHANG 105
7.1 Abkürzungsverzeichnis 105
7.2 Publikation von Teilen der Arbeit 106
7.3 Danksagung 107
7.4 Lebenslauf 108
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