Die Regulation der zentralen Stoffwechselwege in Bacillus subtilis: Interaktion von Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis V
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 3
2.1. Genregulation als Spiegel des Lebens 3
2.2. Die zentralen Stoffwechselwege 5
2.2.1. Die Glycolyse 7
2.2.2. Der Pentosephosphat Weg 8
2.2.3. Der Zitronensäure Zyklus 8
2.2.4. Die Gluconeogenese 10
2.2.5. Die Redoxbalance und der Überflussmetabolismus 11
2.2.6. Die Ammoniumassimilation 12
2.3. Genregulation in B. subtilis 13
2.3.1. Regulation in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle 13
CcpA als übergeordneter Regulator 13
Die zwei Klassen der CcpA abhängigen Regulation 14
2.3.2. Regulation in Abhängigkeit von der Stickstoffquelle 16
2.3.3. Berührungspunkte der C und N Quellen abhängigen Regulation 17
Die Regulation des Zitronensäurezyklus 17
Die Regulation der Glutamat Synthase 19
2.4. Ziel der Arbeit 20
3. Material und Methoden 21
3.1. Bakterienstämme und Plasmide 21
3.1.1. Bakterienstämme 21
3.1.2. Plasmide 23
3.2. Puffer, Lösungen und Medien 24
3.2.1. Bakteriennährmedien und fakultative Zusätze 24
Antibiotika 27
3.3. Methoden 28
3.3.1. Allgemeine Methoden 28
3.3.2. Anzucht von Bakterien 28
3.3.3. Transformation von E. coli 29
T1A Tranrfnmiatinn vnn R tuhtili* 29
Herstellung von kompetenten Zellen Transformation der kompetenten Zellen 3.3.5. Plasmid und Stammkonstruktion Konstruktion einer pfa Deletionsmutante Konstruktion von Plasmiden zur Überexpression von Proteinenin^Ä 31
Konstrukt.on von Plasmiden für die Überexpression von Proteinen in E. coli 3.
3.3.6. Präparation und Nachweis von DNA Aufreinigung von Plasmid DNA über modifizierte Alkali/SDS Lyse 33
Isoherung von chromosomaler DNA aus B. subtilis DNA Gel Elektrophorese Sequenzierung von DNA
34
Restriktion und Ligation von DNA
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Lösungen für das Arbeiten mit DNA 3.3.7. Arbeiten mit Proteinen Zellaufschluss durch Ultraschall Zellaufschluss mit der French Press ^
Denaturierende Proteingel Elektrophorese ^
Überproduktion von Proteinen Aufreinigung von Proteinen über Np NTA Säulen
Aufreimgung über Strep Tactm Sepharose Säule . . Dialyse von Proteinen Antikörpersynthese Westernblot 38
p^iürvon pren m ^ ^^^iL3!
Praparation von Membranfraktionen Lösungen zum Arbeiten mit Proteinen ^
3.3.8. Bestimmung von Enzymaktivitäten ^
Best.mmung der ß GalaktoS1daseaktivität ^
Amylasetest auf Stärkeplatten 42
Vorbereitung der Messung 44
Reversed phase HPLC 44
45
Inhalt in
Auswertung 45
Puffer und Lösungen für Aminosäurekonzentrationsmessungen 46
3.3.10. RNA Analytik 46
RNA Isolation aus B. subtilis 46
Elektrophorese von RNA in denaturierenden Agarosegelen 47
Northernblot 48
Herstellung DIG markierter RNA Sonden 49
Hybridisierung membrangebundener RNA mit DIG markierten RNA Sonden 50
Detektion von RNA/RNA Hybriden 50
Pufferund Lösungen für RNA Isolation und Northemblots 51
Waschlösung 2 x SSC 53
3.3.11 Transkriptomanalysen mittels Macroarrays 54
RNA Isolation 54
Synthese von 33P markierter cDNA 54
Fällung der markierten cDNA 55
Hybridisierung des Macroarrays 55
Die Regeneration eines Arrays 56
Analyse und Auswertung 56
Puffer und Lösungen für die Macroarray Analysen 57
4. Ergebnisse 59
4.1. Transkriptomanalysen zur Genregulation in Abhängigkeit von Glucose 59
4.1.1. Kontrollexperimente 59
Überprüfung der Wachstumsbedingungen 59
Northemblots zur Bestimmung der RNA Qualitüt 60
Scatterplot Analysen als Qualitätskontrolle für Transkriptomdaten 61
4.1.2. Glucose lnduktion 63
4.1.3. Glucose Repression 65
4.1.4. Die glucoseabhängige Regulation der zentralen Stoffwechsehvege 67
DieGlycolyse 68
Der Pentosephosphat Weg 68
Das Schicksal von Pyruvat 69
Der Zitronensäure Zyklus 70
Die Verbindung zum Stickstoffmetabolismus 71
Die Gluconeogenese 71
IV Inhalt 4.1.5. Die glucoseabhängige Regulation des pdh Operons 71
4.2. Der Zitronensäure Zyklus als Schnittstelle von Kohlenstoff und
Stickstoffinetabolismus 74
4.2.1. Allgemeine und spezifische Regulation 74
4.2.2. Die CcpC Expression 75
4.2.3. Die kohlenstoffabhängige Expression von citB 77
4.2.4. Stickstoffabhängige Expression des Zitronensäure Zyklus 80
Eingrenzung der regulierenden Stickstoffkomponente 80
Arginin reprimiert die «V5 Expression glucoseunabhängig 81
Der Zusammenhang mit der allgemeinen Stickstoffregulation 82
Bindungsassay von GlnA und CcpC 84
Der Nachweis von CcpC in Membranfraktionen 86
4.2.5. Die Glutamat Synthase und die Regulation von citB 88
4.2.6. Der intrazelluläre Aminosäurepool 90
5. Diskussion 93
5.1. Keine Zeit zum Energiesparen: Aktivierung des Überfluss Stoffwechsels in
Anwesenheit von Glucose 93
5.2. Das Klassensystem der Kohlenstoffregulation: Unterschiedliche Wirkungsweisen von
CcpA 95
5.3. Das Schicksal von Acetyl CoA reguliert den ZZ: Citrat als Effektor von CcpC 98
5.4. Die Wechselwirkung von Zitronensäurezyklus und N Metabo!ismus 101
5.5. Ausblick 110
6. Literatur 111
7. Anhang 125
7.1. Materialien 125
7.1.1. Chemikalien 125
7.1.2. Hilfsmittel 126
7.1.3. Geräte und Apparaturen 127
7.1.4. Kommerziell erhältliche Systeme 128
7.1.5. Proteine, Antikörper und Enzyme 128
7.2. Oligonukleotide 129
7.3. Verwendete Intemetangebote und Computerprogramme 131
7.4. Spezifikationen der HPLC Läufe 132
7.5. Transkriptomdaten l is
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