Funktionelle Eigenschaften humaner Mesothelzellen im Rahmen der entzündlich-reparativen Serosareaktion:
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| Veröffentlicht: |
2000
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| Beschreibung: | Aachen, Techn. Hochsch., Habil.-Schr., 2000 |
| Beschreibung: | III, 118 S. Ill., graph. Darst. 30 cm |
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1. EINLEITUNG
1.1. Anatomie und Physiologie der Serosa 1
1.2. Entzündlich - reparative Reaktionen der Serosa 3
1.2.1. Klinische Bedeutung fibröser Adhäsionen der Serosa 3
1.2.2. Ursachen und Mechanismen der Serosaschädigung 4
1.2.3. Zelluläre Dynamik der peritonealen Wundheilung 6
1.2.4. Bedeutung und Mechanismus der Plasminogenaktivierung 8
1.2.5. Bedeutung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren 11
1.2.6. Extrazellularmatrixveränderungen 14
1.3. Zielsetzung 16
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. Kultivierung humaner Mesothelzellen 17
2.2. Qualitative und quantitative Nachweisverfahren 18
2.2.1. Immunhistologie und Immunfluoreszenz 18
2.2.1.1. in vivo-Proteinnachweis mittels indirekter Immunoperoxidase-Technik 18
2.2.1.2. in vitro-Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenz 19
2.2.1.2.1. Charakterisierung der Mesothelzellkultur 19
2.2.1.2.2. Integrine 20
2.2.1.2.3. Metallothionein (MT) 20
2.2.2. Enzyme-Linked-Immunoabsobent Assays (ELISAs) 21
2.2.2.1. Plasminogenaktivator vom Gewebe Typ (t-PA) 21
2.2.2.2. Plasminogenaktivator-lnhibitorTyp 1 (PAI-1) 22
2.2.3. Bestimmung der Proteinkonzentration 23
2.2.4. RT-PCR und PCR-ELISA 23
2.2.4.1. t-PA und PAI-1 RT-PCR 24
2.2.4.2. Hitzeschockprotein 72 (Hsp 72) RT-PCR 25
2.2.4.3. PCR-ELISA 26
2.2.5. SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Immunoblot 26
2.2.5.1. SDS-PAGE 27
2.2.5.2. Proteintransfer auf eine Nitrozellulosemembran (Westem-Blot) 27
2.2.5.3. Immunostaining 28
2.3. Funktionelle Untersuchungen 29
2.3.1. Modelle zur Beschreibung pro- und antifibrinolytischer Eigenschaften humaner
Mesothelzellen in vitro 29
2.3.1.1. Multiwell-Assay 29
2.3.1.2. Darstellung mittels konfokaler Laserscanmikroskopie 30
II
2.3.2. Untersuchungen zur zellulären Plasminogenbindung in Abhängigkeit vom Zelltod 30
2.3.2.1. Nachweis der Zelltod-assoziierten Plasminogen Bindung am Monolayer 31
2.3.2.2. Flowzytometrischer Nachweis der Zelltod-assoziierten Plasminogenbindung 32
2.3.2.3. Amidiolytische Aktivitätsbestimmung des Zelltod-assoziierten Plasmin 32
2.3.2.4. Darstellung der perizellulären Fibrinolyse im Rahmen des Zelltods 33
2.3.3. Proliferationsassay (BrdU-ELISA) 33
2.3.4. Experimente zum Adhäsionsverhalten humaner Mesothelzellen auf verschiedenen
Extrazellularmatrix- (EZM-) Komponenten 34
2.3.4.1. Beschichtung mit Extrazellularmatrixkomponenten 34
2.3.4.2. Adhäsionsassay 35
2.3.4.3. Inhibitionsstudien mit Integrin-inhibierenden Antikörpern 36
2.3.5. Migrationsassays 37
2.3.5.1. Scratch-assay 37
2.3.5.2. Transwell-System 37
2.4. Datenverarbeitung und Statistik 38
3. ERGEBNISSE
3.1. Charakterisierung humaner Mesothelzellen in vitro 39
3.2. Pro- und antifibrinolytische Eigenschfaten humaner Mesothelzellen in vitro
3.2.1. t-PA und PAI-1 Konzentrationen im Überstand unstimulierter Mesothelzellen 40
3.2.2. t-PA Konzentrationen unter Einfluß von TNF-a, IL-1 ß und TGF-ßi 40
3.2.3. PAI-1 Konzentrationen unter Einfluß von TNF-a, IL-1ß und TGF-ßi 41
3.2.4. t-PA und PAI-1 mRNA Konzentrationen unter Stimulation mit TNF-a, IL-1 ß und TGF-ßi 43
3.2.5. Antifibrinolytische Wirkung humaner Mesothelzellen unter Stimulation mit TNF-a,
IL-1 ß und TGF-ß, 44
3.2.6. Morphologische Darstellung der zellvermittelten Fibrinolyse mittels konfokaler
Laserscanmikroskopie 47
3.2.7. Plasminogenbindung und -aktivität in Abhängigkeit vom Zelltod 51
3.3. Wechselwirkungen humaner Mesothelzellen mit Extrazellularmatrixkomponenten
3.3.1. Immunhistochemische Darstellung der Integrinexpression humaner Mesothelzellen 56
3.3.2. Adhäsion humaner Mesothelzellen auf verschiedenen Extrazellularmatrixkomponenten 58
3.3.3. Funktionelle Bedeutung der Integrine hinsichtlich der Adhäsion auf Fibronektin,
Vitronektin, Kollagen IV und Laminin 59
3.3.3.1. Adhäsion auf Fibronektin 59
3.3.3.2. Adhäsion auf Vitronektin 60
3.3.3.3. Adhäsion auf Kollagen IV 61
3.3.3.4. Adhäsion auf Laminin 62
3.4. Hsp-73/73 und MT Expression humaner Mesothelzellen 63
3.4.1. Hsp 72/73- und MT-Expression humaner Mesothelzellen in vivo 63
3.4.2. Hsp 72/ 73-Expression humaner Mesothelzellen in vitro 65
3.4.3. HSP 72-mRNA-Analyse in vitro 67
3.4.4. Metallothioneinexpression in vitro 68
III
3.5. c-met-Expression und Wirkung des HGF auf humane Mesothelzellen
3.5.1. Immunhistologische Darstellung der c-met-Expression in vivo 69
3.5.2. c-met-Expression humaner Mesothelzellen in vitro 71
3.5.3. Proliferation humaner Mesothelzellen unter Stimulation mit HGF 72
3.5.4. Migration humaner Mesothelzellen unter Stimulation mit HGF 73
3.5.5. Chemotaktische Wirkung des HGF auf humane Mesothelzellen 74
3.5.6. Bedeutung von u-PA, t-PA, PAI-1 und uPAR für die chemotaktische Wirkung humaner
Mesothelzellen 76
4. DISKUSSION
4.1. Anti- und profibrinolytische Eigenschaften humaner Mesothelzellen unter Einfluß
vonTNF-a, IL-1ßundTGF-ßi 78
4.2. Zelluläre Plasminogenbindung in Abhängigkeit vom Zelltod 84
4.3. Expression und Funktion der ßi- und ß3-lntegrine humaner Mesothelzellen 86
4.4. Expression zytoprotektiver Proteine humaner Mesothelzellen 88
4.5. Reaktionen humaner Mesothelzellen unter Einwirkung des HGF 91
5. ZUSAMMENFASSUNG 94
6. LITERATURVERZEICHNIS 96
7. ANHANG
7.1. Abkürzungen 111
7.2. Reagentien/Antikörper 112
7.2.1. Primärantikörper: Hitzeschockproteine, Metallothionein und c-met 112
7.2.2. Primärantikörper: Intermediärfilamente 112
7.2.3. Primärantikörper: Integrine und Zeiladhäsionsmoleküle 112
7.2.4. Sekundärantikörper: Indirekte Peroxidase 113
7.2.5. Sekundärantikörper und Konjugate: Immunfluoreszenz 113
7.2.6. Reagentien 113
7.3. Gebrauchslösungen und Puffer 114
7.4. Kits 114
7.5. Protokolle 115
7.5.1. Immunhistochemie 115
7.5.1.1. Indirekte Immunoperoxidase Technik 115
7.5.1.2. Immunfluoreszenz (in vitro) 115
7.5.1.3. Präparation von Fibrinogen / Plasminogen und Markierungsreaktionen 116
8. DANKSAGUNG 117
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