Globale Expressionsanalysen zur Charakterisierung der Lysin-Produktion in Corynebacterium glutamicum:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
2003
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3
INHALTSVERZEICHNIS
1
.EINLEITUNG
6
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
14
2.1.
CHEMIKALIEN
14
2.2.
MEDIEN,
STAMMHALTUNG
UND
KULTIVIERUNG
15
2.2.1.
MEDIEN
15
2.2.2.
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
16
2.2.3.
KULTIVIERUNG
18
2.3.
METABOLITBESTIMMUNGEN
18
2.3.1.
AMINOSAEUREBESTIMMUNG
18
2.3.2.
BESTIMMUNG
VON
GLUCOSE
19
2.3.3.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
19
2.3.4.
SPEKTROSKOPIE
VON
CYTOCHROM
21
2.4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN
21
2.4.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
21
2.4.2.
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
22
2.4.3.
RESTRIKTION,
MODIFIKATION
UND
REINIGUNG
VON
DNA
22
2.4.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
23
2.4.5.
TECHNIKEN
ZUR
TRANSFORMATION
VON
ZELLEN
23
2.4.6.
PLASMIDTRANSFER
VON
E.
COLI
NACH
C.
GLUTAMICUM
DURCH
TRANSKONJUGATION
24
2.4.7.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
24
2.4.8.
KONSTRUKTION
VON
DELETIONSMUTANTEN
25
2.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
FUER
DIE
DNA-CHIP-TECHNOLOGIE
26
2.5.1.
PRAEPARATION
VON
RNA
26
2.5.2.
SYNTHESE
FLUORESZENZMARKIERTER
CDNA-SONDEN
26
2.5.3.
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
27
2.5.4.
FLUORESZENZMARKIERUNG
GENOMISCHER
DNA-SONDEN
27
2.6.
DNA-CHIP-TECHNOLOGIE
28
2.6.1.
OBERFLAECHENBESCHICHTUNG
VON
DNA-CHIP-TRAEGEM
28
2.6.2.
AMPLIFIZIERUNG
DER
C.
GLUTAMICUM
GENE
28
2.6.3.
ROBOTERGESTUETZTE
HERSTELLUNG
VON
DNA-CHIPS
29
2.6.4.
CHEMISCHE
UND
THERMISCHE
NACHBEHANDLUNG
VON
DNA-CHIPS
30
2.6.5.
DNA-CHIP-HYBRIDISIERUNG
31
2.6.6.
MESSUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
FLUORESZENZ
VON
DNA-CHIPS
31
2.6.7.
NORMALISIERUNG
DER
RELATIVEN
MRNA-SPIEGEL
33
2.6.8.
VERWALTUNG
UND
ARCHIVIERUNG
VON
DNA-CHIP-DATEN
33
2.6.9.
HIERARCHISCHE
CLUSTER
ANALYSE
33
2.6.10.
STATISTIK
34
3.
ERGEBNISSE
35
3.1.
EINFLUSS
DER
LEUCIN-AUXOTROPHIE
AUF
DIE
LYSINPRODUKTION
35
3.1.1.
HERSTELLUNG
VON
STAEMMEN
MIT
EINER
DELETION
IM
ERSTEN
GEN
DER
LEUCIN-BIOSYNTHESE
LEUA
35
3.1.2.
LYSINPRODUKTION
DER
ZEW4-DELETIONSSTAEMME
UND
DER
ISOGENEN
AUSGANGSSTAEMME
37
4
3.2.
ETABLIERUNG
UND
VALIDIERUNG
DER
DNA-CHIP-TECHNOLOGIE
FUER
C.
GLUTAMICUM
41
3.2.1.
VALIDIERUNG
VON
DNA-CHIP-UNTERSUCHUNGEN
BEI
VERGLEICH
DER
GENOME
UNTERSCHIEDLICHER
C.
GLUTAMICUM
STAEMME
44
3.3.
DNA-CHIP-UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
LYSINBILDUNGS
RELEVANTER
GENREGULATION
47
3.3.1.
WACHSTUMS
UND
PRODUKTIONS-PHASEN
ABHAENGIGE
REGULATION
IN
WILDTYP
UND
MH20-22B
47
3.3.2.
VERGLEICH
DER
GENEXPRESSION
ZWISCHEN
WILDTYP
UND
MH20-22B
51
3.3.3.
VERGLEICH
DER
GENEXPRESSION
ZWISCHEN
WILDTYP
UND
MH20-22B
IN
DER
EXPONENTIELLEN
PHASE
52
3.4.
UNTERSUCHUNG
DER
EINFLUESSE
SPEZIFISCHER
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
WILDTYP
UND
MH20-22B
57
3.4.1.
DIFFERENZIERUNG
VON
EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN
ALS
FOLGE
DER
ANWESENHEIT
EINER
FEEDBACKRESISTENTEN
ASPARTATKINASE
58
3.4.2.
DIFFERENZIERUNG
VON
EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN
ALS
FOLGE
UNTERSCHIEDLICHER
STAMMHINTERGRUENDE
62
3.4.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
LEUCINAUXOTROPHIE-ABHAENGIGEN
REGULATION
68
3.4.4.
KOMBINATORISCHE
ANALYSE
DER
LYSINPRODUKTIONS-ABHAENGIGEN
EXPRESSION
74
3.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZU
CHROMOSOMALEN
UNTERSCHIEDEN
DER
MODELLSTAEMME
78
3.6.
UEBERPRUEFUNG
SPEZIFISCH
REGULIERTER
GENE
BEZUEGLICH
EINFLUSS
AUF
DIE
LYSINPRODUKTION
81
3.6.1.
UEBEREXPRESSION
DES
OPERONS
DER
GRUPPE
1
(HEMU-HMUT-FEPC)
83
3.6.2.
UEBEREXPRESSION
DER
GENE
UND
OPERONS
DER
GRUPPE
2
86
3.6.3.
UEBEREXPRESSION
DER
GENE
DER
GRUPPE
3
89
4.
DISKUSSION
91
4.1.
UNTERSCHIEDE
IN
DER
GENEXPRESSION
ZWISCHEN
WILDTYP
UND
PRODUKTIONSSTAMM
91
4.2.
AUSWIRKUNG
MH20-22B-SPEZIFISCHER
MERKMALE
AUF
DIE
GENEXPRESSION
94
4.3.
LYSINPRODUKTIONS-SPEZIFISCHE
REGULATION
103
4.4.
UEBEREXPRESSION
IDENTIFIZIERTER
ZIELGENE
ZUR
VERBESSERUNG
DER
LYSINPRODUKTION
105
5.
ZUSAMMENFASSUNG
110
6.
LITERATURVERZEICHNIS
112
7.
ANHANG
128 |
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