Bedeutung intra- und intermolekularer Wechselwirkungen für die Funktion des muskulären Chloridkanals ClC-1:
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Mainz
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| adam_text | • Inhaltsverzeichnis I
1 EINLEITUNG 1
1.1 Chloridkanäle 1
1.2 Die CIC-Kanal Familie 2
1.2.1 Vorkommen und physiologische Bedeutung von CIC-0, CIC-1, CIC-2 und CIC-Ka/b ...2
1.2.2 Überblick über die übrigen CIC-Kanäle 3
1.3 Struktur der eukaryotischen CIC-Kanäle 5
1.3.1 Die Kristallstruktur 5
1.3.2 Der C-Terminus 6
1.3.3 Die CBS-Domänen 7
1.4 Eigenschaften von CIC-Kanälen 8
1.4.1 Anionenselektivität 8
1.4.2 Öffnungs- und Schließmechanismen 9
1.5 Ziel der Arbeit 13
2 MATERIAL UND METHODEN 15
2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 15
2.2 Herstellung von Standardlösungen 15
2.3 Oligonukleotide 15
2.4 Vektoren 17
2.5 Pro- und eukaryotische Zelllinien 17
2.5.1 Bakterienstämme 17
2.5.2 Eukaryotische Zelllinien 17
2.6 Kultivierung prokaryotischer Zellen 18
2.7 Molekularbiologische Methoden 18
2.7.1 Herstellung kompetenter Zellen 18
2.7.2 Transformation von Bakterien 19
2.7.3 Präparation von Plasmid-DNA 19
2.7.4 Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA 19
2.7.5 DNA-Restriktion 20
2.7.6 Elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten 20
2.7.7 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 21
II Inhaltsverzeichnis
2.7.8 DNA-Ligation 21
2.7.9 DNA-Sequenzierung 22
2.7.10 Herstellung verschiedener Konstrukte aus hCIC-1 22
2.7.11 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 23
2.7.12 Verwendete Konstrukte 24
2.8 Zellbiologische Methoden 26
2.8.1 Kultivierung eukaryotischer Zelllinien 26
2.8.2 Transfektion 26
2.9 Elektrophysiologische Methoden 27
2.9.1 Der Messplatz 27
2.9.2 Glasmikroelektroden 27
2.9.3 Mess-und Referenzelektrode 28
2.9.4 Die Messinstrumente 28
2.9.5 Herstellung eines Gigaseals 29
2.9.6 Patch-Konfigurationen (Hamill et al. 1981) 30
2.9.6.1 cell-attached 30
2.9.6.2 inside-out 30
2.9.6.3 whole-cell (Ganzzellableitung) 31
2.9.6.4 outside-out 31
2.9.7 Vorzeichenkonvention 32
2.9.8 Aufnahmebedingungen 32
2.9.9 Lösungen 32
2.9.10 Modifikation mit MTS-Reagenzien 33
2.9.11 9-AC-Block 34
2.9.12 Datenanalyse 34
2.9.12.1 Bestimmung der Permeabilitäten 34
2.9.12.2 Relative Leitfähigkeit 35
2.9.12.3 Rauschanalyse 35
2.9.12.4 Aktivierungskurven 37
2.9.12.5 Deaktivierungszeitkonstanten und fraktionale Amplituden 40
2.9.12.6 Öffnungsratenkonstanten 40
2.10 Konfokale Mikroskopie 41
Inhaltsverzeichnis III
3 ERGEBNISSE 43
3.1 Die funktionelle Bedeutung des C-Terminus in hCIC-1 43
3.1.1 C-terminal verkürzte hCIC-1 Kanäle 43
3.1.2 Elektrophysiologische Untersuchung der verkürzten hCIC-1 Kanäle 43
3.1.3 Subzelluläre Lokalisation der verkürzten hCIC-1 Kanäle 45
3.1.4 Funktionsfähigkeit der verkürzten hCIC-1 Kanäle 46
3.2 Identifizierung und Untersuchung funktioneller Domänen im hCIC-1 C-Terminus 50
3.2.1 Deletionen der N-terminalen CBS-Domäne und der Aminosäuren D662-S818 50
3.2.2 Bedeutung der CBS-Domänen für die Funktion von hCIC-1 52
3.2.3 Interaktionen innerhalb des C-Terminus von hCIC-1 54
3.2.4 Interaktion der C-Termini innerhalb eines Kanaldimers 58
3.3 Funktionelle Charakterisierung der Mutanten R894X hCIC-1 und K875X hCIC-1 59
3.3.1 Funktionale Expression von R894X hCIC-1 und K875X hCIC-1 59
3.3.2 Deaktivierungszeitkonstanten und fraktionelle Amplituden 60
3.3.3 Selektivität und Einzelkanalamplitude 61
3.3.4 Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit 63
3.3.5 Chloridabhängigkeit der Aktivierungskurven 65
3.3.6 Öffnungsratenkonstanten 66
3.3.7 lodid- und Nitratblock 67
3.3.8 MTSET-Modifikation an K231C 69
3.4 Einfluss und Bedeutung des slow gates 71
3.4.1 Die Punktmutation C277S hCIC-1 71
3.4.1.1 Die Aktivierungskurven 71
3.4.1.2 lodidblock 72
3.4.1.3 MTSET Modifikation an K231C 73
3.4.2 Beeinflussung des lodidblocks durch den Offenzustand des stow gafes 74
3.4.3 Der Einfluss des slow gates auf beide Protoporen 77
3.4.3.1 Untersuchung von Poreneigenschaften mit Hilfe des fast gates 77
3.4.3.2 Übertragung von Gatingeigenschaften zwischen den beiden Protoporen 80
!V INHALTSVERZEICHNIS
4 DISKUSSION 83
4.1 Untersuchung funktioneller Domänen des C-Terminus 83
4.1.1 C-terminal verkürzte hCIC-1 Kanäle 83
4.1.2 Die CBS-Domänen 85
4.2 Intra- und intermolekulare Wechselwirkungen des C-Terminus 86
4.2.1 Interaktionen innerhalb des C-Terminus 86
4.2.2 Interaktionen zwischen den Transmembrandomänen und dem C-Terminus 88
4.2.3 Interaktionen zwischen den C-Termini eines Kanaldimers 89
4.3 Veränderungen des Gatings durch verkürzte C-Termini 89
4.4 Einfluss des slow gates auf Poreneigenschaften 92
4.5 Allosterische Interaktionen zwischen den beiden Protoporen 93
4.6 Ein neues Gatingmodell für hCIC-1 93
4.7 Die Bedeutung der doppelläufigen Kanalarchitektur 95
5 ZUSAMMENFASSUNG 97
6 LITERATURVERZEICHNIS 99
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