Effekt von neuronalen Differenzierungsprozessen und Psychopharmakabehandlung auf die Genexpression von neuroendokrinen Phäochromozytomzellen:
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2004
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 7
7
1.1. Erkrankungen mit Trinukleotid-Repeat-Expansion
Q
1.1.1. Genetische Antizipation bei psychiatrischen Erkrankungen
1.1.2. Repeat-Expansions-Detektions-Methode
1.2. DNS- und RNS-Fmgerprinttechniken l0
1.3. Die PC12Zelllinie als neuronales in vitro Modell ^
1.3.1. Klassifizierung der PC12 Zellen 13
1.3.2. PC12 Zeil-Metabolismus I4
1.3.3. PC 12 Zeil-Rezeptoren 15
1.3.4. Neuronale Differenzierung der PC 12 Zellen mit dem Nervenwachstums-
faktor (NGF) 16
1.4. NGF-ldentifizierung 18
1.4.1. NGF-Komplex-Bildung 19
1.4.2. NGF-Gen-Deletion 19
1.4.3. Tyrosin-Kinase-Rezeptor (Trk), ein spezifischer NGF-Rezeptor 20
1.4.4. Trk-Rezeptor-Signaltransduktion 21
1.4.5. Trk-Rezeptor-Gen-Deletion 21
1.4.6. p75-Rezeptor, ein niedrig affiner NGF-Rezeptor 22
1.4.7. p75-Rezeptor-Gen-Deletion 23
1.4.8. Halluzinogen induzierte psychische Störung 23
1.5. Zielsetzung der Arbeit 25
2. Material und Methodik 27
2.1. Material 27
2.1.2. Eingesetzte Gerätschaften 28
2.1.3. Puffer und Lösungen 28
2.1.4. PCR-Primer 30
2.2. Methoden 31
2.2.1. Ribonukleinsäure-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion
(RNS-RT-PCR) 31
2.2.2. RNS-Isolierung 33
2.2.3. cDNA-Erststrang-Synthese 33
2.2.4. cDNA-Zweitstrang-Synthese (PCR) 34
4
2.2.5. Agarose-Gelelektrophorese 35
2.2.6. Polyacrylamid-Gelelektophorese 36
2.2.7. Reamplifizierung von PCR-Produkten 36
2.2.8. Insert Polishing und Restriktionsverdau des Plasmids p-Bluescript 2KS 37
2.2.9. Ligation der PCR-Fagmente 38
2.2.10. LB-Ampicillin-Platten 38
2.2.11. Kompetente Bakterien 38
2.2.12. Transformation kompetenter Bakterien 39
2.2.13. Plasmid Mini-Präparation 39
2.2.14. Kategorieneinteilung der regulierten PCR-Produkte 40
2.2.15. Kultivierung von PC 12 Zellen 42
2.2.16. Differenzierung von PC 12 Zellen 43
2.2.17. Zytotoxizitätstestung 43
2.2.18. Immunhistochemische Färbung 44
3. Ergebnisse 45
3.1. Zellkulturexperimente 45
3.1.1. Kultivierung und Differenzierung der PC 12 Zellen 45
3.1.2. Behandlung der PC12 Zellen mit Methamphetamin oder Haloperidol 49
3.2. Reverse Transkription 50
3.2.1. Allgemeine Reaktionsbedingungen der Reversen Transkription 50
3.2.2. Allgemeine Reaktionsbedingungen der cDNA-Zweitstrangsynthese 50
3.3. Verwendung des nicht verankerten Trinukleotid-Primers Tril 51
3.3.1. Verwendung der kurzen verankerten Trinukleotid-Primer 51
3.3.2. Verschachtelte (nested) PCR 52
3.3.3. Verwendung degenerierter Primer 52
3.3.4. Verwendung der langen verankerten Trinukleotid-Primer 53
3.4. Detektion von Polymorphismen 53
3.4.1. UnbehandeltePC12 Zellen versus NGF behandelte PC12 Zellen 54
3.4.1.1. Primerkombination: (CAG)3AT/AP1 54
3.4.1.2. Primerkombination: Tril/Glil 55
3.4.2. Unbehandelte PC12 Zellen versus Methamphetamin behandelte
PC12 Zellen 57
3.4.3. Unbehandelte PC 12 Zellen versus Haloperidol behandelte PC 12 Zellen 59
3.4.4. NGF behandelte PC12 Zellen versus NGF und Methamphetamin
behandelte PC 12 Zellen 61
5
3.4.5. NGF behandelte PC 12 Zellen versus NGF und Haloperidol behandelte
PC 12 Zellen 65
3.5. Spezifische RT-PCR 67
4. Diskussion 72
4.1. Genetische Basis psychiatrischer Erkrankungen 72
4.2. PCR-Methodik zur Detektion repetitiver Gen-Sequenzen 74
4.3. Darstellung polymorpher Fragmente und ihre Regulierung 78
4.4. Sequenzanalysen 80
5. Zusammenfassung 85
6. Literaturverzeichnis 88
7. Anhang 103
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