Die Wirkung von Fibrinkleber (Tissucol) im Hinblick auf die Proliferation, die Differenzierung und die Zytotoxizität von Osteoblasten in vitro:
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung
1.1 Allgemeine Einleitung 1
1.2 Osteochondrosis dissecans 1
1.3 Fibrinkleber 2
1.4 Knochenaufbau 5
1.4.1 Allgemeiner Aufbau des Knochens 5
1.4.2 Zelluläre Grundlagen der Knochenbildung 6
1.4.3 Knochenzellen 7
1.4.4 Vorläuferzellen 7
1.4.5 Osteoblasten 8
1.4.6 Osteozyten 9
1.4.7 Osteoklasten 10
1.4.8 Interaktionen zwischen Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten 10
1.4.9 Grenzschichten des Knochens 12
1.4.9.1 Periost 13
1.4.9.2 Endost 13
1.5 Theorie der Knochentransplantation 14
1.5.1 Osteogenese 14
1.5.2 Osteoinduktion 14
1.5.3 Osteokonduktion 15
1.6 Alkalische Phosphatase 15
1.7 Osteocalcin 16
1.8 Osteoblastenzellkultur und Tierversuche 17
1.9 Fragestellung 18
2. Material und Methoden
2.1 Material 20
2.1.1 Gewebe 20
2.1.2 Chemikalien, Lösungen, Medikamente, Reagenzien 22
2.1.3 Gebrauchs-und Verbrauchsmaterial 23
2.1.4 Geräte 24
2.2 Methoden 25
2.2.1 Zellkulturmethoden 25
2.2.1.1 Allgemeines 25
2.2.1.2 Anlegen von Primärkulturen humaner Zellen 25
2.2.1.2.1 Anlegen humaner Knochenzellkulturen aus Spongiosa 25
2.2.1.3 Medium 26
2.2.1.3.1 Herstellen des Vollmediums 27
2.2.1.3.2 Mediumswechsel 27
2.2.1.4 Subkultivierung von Zellen 28
2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 29
2.2.1.6 Kryokonservierung 30
2.2.2 Methoden zur Untersuchung der verschiedenen Zellparameter 32
2.2.2.1 Allgemeiner Versuchsaufbau 32
2.2.2.2 RT/ PCR 33
2.2.2.2.1 Allgemeines 33
2.2.2.2.2 RNA-Präparation einer Monolayer-Zellkultur mit dem RNeasy-Kit 35
2.2.2.2.3 cDNA-Synthese 37
2.2.2.2.4 Primerpaare 38
2.2.2.2.5 RT-Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 39
2.2.2.2.6 Nachweis der amplifizierten Produkte 40
2.2.2.3 Bestimmung der Osteocalcin Synthese 42
2.2.2.4 Zytotoxizitätstest mit WST-1 44
2.2.2.5 DNA-Synthese-Array: BrdU-ELISA 45
2.2.2.6 Nachweismethoden der Alkalischen Phosphatase 46
2.2.2.6.1 Herstellen von Zellysaten 46
2.2.2.6.2 Aktivitätsbestimmung der Alkalischen Phosphatase 47
2.2.2.7 LDH-Test 47
2.2.3 Statistik 49
3. Ergebnisse
3.1 Zellkultur 50
3.2 Bestimmung der Zellzahl mittels Neubauer Zählkamme 53
3.3 BrdU- ELISA 53
3.4 Zytotoxizitätstest mit WST-1 56
3.5 Osteocalcinbestimmung 57
3.6 Bestimmung der Alkalischen Phosphatase 58
3.7 Bestimmung der Zytotoxizität durch LDH-Aktivitätsmessung 59
3.8 PCR ¦ 60
3.8.1 RNA-Isolierung 61
3.8.2 cDNA-Synthese 61
3.8.2.1 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 61
3.8.2.2 Beta 2 Microglobulin 62
3.8.3 RT-Polymerase Ketten Reaktion 62
3.8.3.1 Kollagen I(a1) 62
3.8.3.2 Osteocalcin 62
3.8.3.3 Osteopontin 62
3.8.3.4 Alkalische Phosphatase 63
4. Diskussion und Schlußfolgerungen
4.1 Bewertung der eingesetzten Methoden 64
4.1.1 Zellkultur 64
4.1.2 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer Zählkammer 66
4.1.3 BrdU ELISA 67
4.1.4 WST-1 Test 67
4.1.5 Osteocalcin Messung 68
4.1.6 Alkalische Phosphatase 69
4.1.7 Laktatdehydrogenase Aktivitätsbestimmung 69
4.1.8 PCR 70
4.2 Beurteilung der Ergebnisse 71
4.2.1 Zellkultur 71
4.2.2 BrdU-ELISA 73
4.2.3 WST-1 Test 74
4.2.4 Osteocalcin Bestimmung 75
4.2.5 Alkalische Phosphatase Messung 76
4.2.6 LDH-Test 76
5. Zusammenfassung 76
6. Literaturverzeichnis 7g
7. Anhang gg
7.1 SOP 96
Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Publikationen
Lebenslauf
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