Einflüsse von rh-IGF-I auf die Cyclosporin-A-induzierte Apoptose in LLC-PK 1:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2004
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| Beschreibung: | München, Techn. Univ., Diss., 2004 |
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| adam_text | 1. ABKÜRZUNGEN 8
2. ZIELE DER ARBEIT 9
3. EINLEITUNG 9
3.1 Bedeutung des Zelltods 11
3.1.1 Apoptose 11
3.1.1.1. Charakteristik^ der Apoptose 13
3.1.1.2. Molekulare Kontrolle von Apoptose 14
3.1.1.3 Nachweisverfahren für Apoptose 18
3.1.1.4. Bedeutung von Apoptose in nephrologischen Erkankungen 19
3.1.2. Nekrose 19
3.2CyclosporinA 22
3.2.1. Wirkmechanismus des Cyclosporin A 22
3.2.2. Bioverfügbarkeit und Metabolismus 23
3.2.3. Anwendungsgebiete von Cyclosporin A 24
3.2.4. Nebenwirkungen von Cyclosporin A 24
3.2.5. Pathomechanismus der Cyclosporin-A induzierten renalen Schädigungen 25
3.2.6. Therapieversuche zur Einschränkung der CyA-Nephropathie 27
3.3. Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) 29
3.3.1. Insulin-like Growth Factor I-Bindungsproteine (IGFBP) 30
3.3.2. Effekte von IGF-I 30
3.3.3. Einsatz von rh-IGF-I bei renalen Erkrankungen 31
3.3.4. IGF-I und Apoptose 32
3.4. Stickstoffmonoxid (Nitric Oxide, NO) 35
3.4.1. NO Synthese 35
3.4.2. NO in der Niere 36
3.4.3. Cyclosporin A und NO 36
3.4.4. IGF-I und NO 36
3.4.5. NO und Apoptose 37
4. MATERIAL UND METHODEN 38
4.1. Zellmaterial 38
4.2. Reagenzien 38
4.2.1. Cyclosporin A(lmg/ml) 38
4.2.2. recombinant human Insulin-like Growth Factor I (rh-IGF-I) 38
4.2.3. Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO BRL/Life technologies)39
4.2.4. RPMI 1640 (GIBCO BRL/Life technologies) 39
4.2.5. Phosphate Buffered Saline (PBS) (GIBCO BRL/Life technologies) 40
4.3. Zellkultur 40
4.3.1. Mediumwechsel 41
4.3.2. Subkultivierung der adhärent wachsenden LLC-PKi-Monolayerkulturen 41
4.4. Inkubationsschema 44
4.5. Tests 45
4.5.1. TUNEL Test (In situ Cell death detection Kit, AP) (Boehringer Mannheim/Roche
Molecular Biochemicals) 45
4.5.2. BrdU Colorimetric Assay (Cell Proliferation ELISA BrdU Colorimetric) 47
(Boehringer Mannheim/Roche Molecular Biochemicals)) 47
4.5.3. Cell Proliferation Kit II (XTT) (Colorimetric Assay (XTT based) for non-
radioactive quantification of Cell Proliferation and Viability) (Boehringer
Mannheim/Roche Molecular Biochemicals) 50
3
4.5.4. NO TEST (Nitric Oxide Colorimetric Assay) (Boehringer Mannheim/Roche
Molecular Biochemicals) 52
4.5.5. Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit (Calbiochem/Merck) 54
4.6. ELISA-Mikrotiterplatten-Lesegerät (MTX, Dynex Technologies) 56
4.7. Statistische Auswertungen 56
5. ERGEBNISSE 58
5.1. Inkubation von LLC-PK1 mit verschiedenen Dosen Cyclosporin A (80umol (II.),
120umol(III.), 160umol(IV.)) 58
5.2. Gleichzeitige Inkubation von LLC-PK1 mit verschiedenen Dosen CyA (80umol (Ha.),
120umol(IIIa.), 160umol(IVa.))und lOOumol rh-IGF-1 72
6. DISKUSSION 78
7. ZUSAMMENFASSUNG 90
8. REFERENZEN 92
9. DANKSAGUNG 98
4
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Schematischer Ablauf der Apoptose 14
Abbildung 2: Schematischer Ablauf der Nekrose 20
Abbildung 3: Strukturformel Cyclosporin A 22
Abbildung 4: Netzeinteilung in der Neubauer Zählkammer Abbildung 5: Schema der
Zellauszählung 43
Abbildung 6: Prinzip des TUNEL Tests/Einbau von dUTP in die DNA 45
Abbildung 7: 5-Bromo-2^deoxyuridin (BrdU) 48
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Umwandlung des Stoffes XTT in farblich
erkennbares Formazan 51
Abbildung 9: Ergebnisse TUNEL Test 59
Abbildung 10: Ergebnisse BrdU Colorimetric Assay 65
Abbildung 11: Ergebnisse BrdU Colorimetric Assay 65
Abbildung 12: Ergebnisse BrdU Colorimetric Assay: 66
Abbildung 13: Ergebnisse BrdU Colorimetric Assay 66
Abbildung 14: Ergebnisse Cell Proliferation Assay (XTT) 68
Abbildung 15: Ergebnisse NO Colorimetric Assay 70
Abbildung 16: Ergebnisse Caspase-3 Cellular Activity Assay 72
5
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Morphologische Unterschiede zwischen Apoptose und Nekrose 21
Tabelle 2: Inkubationsschema für LLC-PKi 44
Tabelle 3: Ergebnisse TUNEL Test (mit Standardabweichungen) 59
Tabelle 4: Ergebnisse BrdU-Test (mit Standardabweichungen) 64
Tabelle 5: Ergebnisse Cell Proliferation Assay (mit Standardabweichungen) 68
Tabelle 6: Ergebnisse NO Colorimetric Assay (mit Standardabweichungen) 69
Tabelle 7: Ergebnisse Caspase-3 Cellular Activity Assay (mit Standardabweichungen) 71
6
FOTOVERZEICHNIS
FOTO 1: TUNEL Test Gruppe I.: LLC-PK, inkubiert mit lOOul DMEM (Kontrolle) 60
FOTO 2:TUNEL Test Gruppe Ia.: LLC-PK, inkubiert mit lOOumol rh-IGF-1 60
FOTO 3: TUNEL Test Gruppe II.: LLC-PK, inkubiert mit 80umol CyA 60
FOTO 4: TUNEL Test Gruppe Ha.: LLC-PKi inkubiert mit 80umol CyA und lOOumol rh-
IGF-1 61
FOTO 5: TUNEL Test Gruppe III.: LLC-PK, inkubiert mit 120umol CyA 61
FOTO 6: TUNEL Test Gruppe lila.: LLC-PK, inkubiert mit 120umol CyA und lOOumol rh-
IGF-1 61
FOTO 7: TUNEL Test Gruppe IV.: LLC-PKi inkubiert mit 160umol CyA 62
FOTO 8: TUNEL Test Gruppe IVa.: LLC-PKi inkubiert mit 160nmol CyA und lOOumol rh-
IGF-1 62
7
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