CDRIII-Polymerase-Kettenreaktion mit patientenspezifischen Primern zum Nachweis von minimalen Resttumorzellen bei Lymphompatienten:
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2004
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Abkürzungen Vl
1. EINLEITUNG 1 j
r
2. MATERIALIEN UND METHODEN 14 j
2.1 Probenmaterial 13
2.2 Isolierung genomischer DNA 15
2.2.1 Vorbereitung des Probenmaterials zur DNA Präparation 15
2.2.2 Phenolextraktion 16 ,
2.3 Photometrische Quantifizierung von DNA und Oligonukleotiden 17
2.4 Polymerasenkettenreaktion 17
2.4.1 Consensus Primer PCR 19 :
2.4.2 Nested Primer PCR 19
j
2.4.3 Synthese von Oligonukleotiden 20
2.5 Transformations und Klonierungstechniken 21
2.5.1 Ligierung in den TA Vektor 21
2.5.2 Transformation 23
2.6 Isolierung von Plasmid DNA 25
2.7 Restriktionsspaltung von Plasmid DNA 26
2.8 Sequenzierung 27
2.9 Charakterisierung von PCR Produkten 29
2.9.1 Agarose Gelelektrophorese 29
IV
2.9.2 Sondenmarkierung 31
2.10 Detektion und Quantifizierung von Tumorzellen 32
2.10.1 Detektion minimaler residueller Tumorzellen 32
2.10.2 Quantifizierung der minimalen Resterkrankung 33
2.11 Allgemein verwendete Materialien 33
2.11.1 Lösungen und Reagenzien 33
2.11.2 Enzyme 34
2.11.3 Gele 35
2.11.4 Pufferlösungen 36
2.11.5 Kulturmedia 38
3. ERGEBNISSE 40
3.1 Patienten und DNA Gehalt der untersuchten Proben 40
3.2 Entwicklung einer patientenspezifischen Gensonde 41
3.2.1 Patientenspezifische CDRIII Sequenzen 45
3.2.2 Patientenspezifische Gensonden 47
3.2.3 Speziftät, Sensitivität und Kontrollen der PCR Reaktion 49
3.3 Nachweis klonaler Zellen 51
3.4 Quantifizierung klonaler Zellen 51
3.4.1 Bestimmung der initialen Tumorlast 53
3.4.2 Bestimmung der minimalen Restkrankheit 54
3.4.1 Effizienz einer immunomagnetischen ex vivo Tumorzelldepletion 57
4. DISKUSSION 59
5. ZUSAMMENFASSUNG 70
6. LITERATUR 71
Danksagung
Lebenslauf
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