Etablierung eines Verfahrens zur fluoreszenzbasierten Genfragmentanalyse für die quantitative Charakterisierung des hämatopoetischen Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation:
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1. Einleitung
1.1 Entwicklung der Stammzelltransplantation beim Menschen 1
1.2 Stammzelltransplantation im Kindesalter 3
1.3 Probleme im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation 4
1.3.1 Transplantatassoziierte Toxizität 4
1.3.2 Infektionen 5
1.3.3 Graft-Versus-Host Disease 6
1.3.4 Transplantatabstoliung 8
1.4 Rezidiv nach Stammzelltransplantation 9
1.4.1 Rezidivtherapie nach Stammzelltransplantation 11
1.4.2 Chemotherapie zur Rezidivbehandlung 11
1.4.3 Zweite Stammzelltransplantation zur Rezidivbehandlung 11
1.4.4 Immuntherapie zur Rezidivbehandlung nach SZT 12
1.5 Rezidivfrüherkennung nach allogener Stammzelltransplantation 13
1.6 Analyse des hämatopoetischen Chimärismus 14
1.6.1 Begriffsbestimmungen 14
1.6.2 Methoden zur Chimärismusanalyse 16
1.6.3 Bedeutung des hämatopoetischen Chimärismus für das
Wiederauftreten der Grunderkrankung bei Patienten mit
malignen hämatologischen Systemerkrankungen 17
1.7 Zielsetzung der Arbeit 19
2. Material 21
2.1 Arbeitsmaterial 21
2.2 Reagentien 21
2.3 Primer-Sequenzen 22
2.4 Polyacrylamidelektrophorese 22
2.4.1 Fluoreszenz PCR 23
2.5 Geräte 23
3. Methoden . 23
3.1 Isolieren von DNA aus Blutproben 23
3.2 Photometrische Bestimmung des DNA - Gehaltes 25
3.3 Polymerase Kettenreaktion (Polymerase - Chain - Reaction PCR) 25
3.4 Thermocyclerprogramme, die routinemäßig eingesetzt werden 27
3.5 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 27
3.6 Kapillarelektrophorese 28
3.7 ABIPrism310 29
3.8 Herstellen der Verdünnungsreihen 30
4. Ergebnisse 33
4.1 Welche STR - Primer können im Gerät eingesetzt werden und
führen in Bezug auf Sensitivität und Informativität zu optimalen
Ergebnissen? 33
4.2 Wie hoch ist die erforderliche DNA - Menge, um veriässliche
Resultate zu erzielen, auch im Vergleich PAGE und
Kapillarelektrophorese ? 47
4.3 Wie hoch ist die Sensitivität zum Nachweis der Minorpopulation
mit Hilfe der Kapillarelektrophorese beim Einsatz von
STR - Primern? 53
4.4 Wie erfolgt die quantitative Auswertung von Proben mit
gemischtem Chimärismus? 55
4.5. Wie ist die Korrelation zwischen STR - PCR und Fluoreszenz-
in-situ-Hybridisierungs-Technik? 58
5. Diskussion 60
5.1 Spezifrtät /Informativität der Methode 63
5.2 Erforderliche DNA - Menge für die Methode 66
5.3 Sensitivität der Methode 67
5.4 Vergleich zwischen STR-PCR und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-
Technik 67
5.5 Vorteile der gerätegestützten STR-PCR 68
5.6 Ausblick 68
Zusammenfassung 69
Literaturverzeichnis 72
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