Infantile nephropatische Cystinose: Charakterisierung und vergleichende Analyse von Mutationen im Cystinosin-Gen
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2004
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Cystinose 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2lnzidenz 1
1.1.3 Diagnose 1
1.1.4 Klinische Manifestation 2
1.1.5 Die infantil nephropatische Verlaufsform 3
1.1.6Pathogenese 9
1.1.7Therapiem6glichkeiten 10
1.2 Prinzipien und Strategien zur Identifizierung von Krankheitsgenen 12
1.2.1 Funktionelle Klonierung 13
1.2.2Positionelle Klonierung 14
1.2.3Positionsunabhangige und positionelle
Kandidatengenverfahren 14
1.3 Identifizierung des Cystinose Gens 15
1.4 Cystinosin: Exon Intron Struktur 16
1.5 Suche von Mutationen zur Bestatigung eines Kandidatengens 18
1.5.1 Mutationen 18
1.5.1.1 Mutationsklassen im menschlichen Genom 19
1.5.1.2 Pathogene Mutationen 19
1.5.1.2.1 Funktionsverlustmutationen 21
1.5.1.2.2 Funktionsgewinnmutationen 22
1.5.2 Grundlagen der Mutationssuche 23
1.5.2.1 Allgemeine Suchverfahren 23
1.5.2.2 Einzelnachweisverfahren 25
1.6 Bisher bekannte Mutationen im CTNS Gen 27
1.6.1 Deletionen 27
1.6.2 Kleinere Mutationen im CTNS Gen 28
2. Fragestellung 29
2.1 Vorarbeiten 29
2.2 Identifizierung des fur die Cystinose verantwortlichen Gens 29
2.3 Ziel der Arbeit 30
3. Material und Methoden 31
3.1 Material 31
3.1.1 Chemikalien und Losungsmittel 31
3.1.2 Enzyme 31
3.1.3 Materialien fur mikrobiologische Arbeiten 31
3.1.4Diverses 32
3.1.5 Puffer und Losungen 32
Inhaltsverzeichnis
3.1.6Gerate 33
3.2 Methoden 35
3.2.1 DNA lsolierung 35
3.2.1.1 Isolierung von DNA aus EDTA Vollblut 35
3.2.1.2 Analytische Plasmidisolierung 35
3.2.1.3 Bestimmung von Konzentration und Reinheit
von Nukleinsauren 36
3.2.2 Polymerase Kettenreaktion 36
3.2.2.1 Verwendete Primer 38
3.2.2.2 Amplifikationsbedingungen 39
3.2.3 Multiplex PCR 39
3.2.4 Gelsysteme und Elektrophoresetechniken 40
3.2.4.1 Agarose Gelelektrophorese von DNA 40
3.2.4.2 Denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese 40
3.2.4.3 DNA GroRenstandards 41
3.2.4.4 Farbung und Photographieren von Nukleinsauregelen
mit Ethidiumbromid 42
3.2.5Aufreinigung von PCR Fragmenten 43
3.2.6 Methoden der DNA Rekombination 44
3.2.6.1 Restriktionsenzymatische DNA Spaltung 44
3.2.6.2 Klonierung von PCR Produkten 44
3.2.6.2.1 TopoTA Klonierung 44
3.2.6.2.2 Dephosphorylierung 45
3.2.6.2.3 Ligation 45
3.2.6.2.4 Anzucht und Stammhaltung von Bakterien 46
3.2.6.2.5 Herstellung kompetenter Zellen 46
3.2.6.2.6 Plasmidtransformation 46
3.2.6.2.7 Selektion positiver Transformanten 47
3.2.7 DNA Sequenzierung 47
3.2.7.1 Verwendete Sequenzierprimer 47
3.2.7.2 Sequenzierungsreaktion 48
3.2.8 Segregationsanalyse 49
4. Ergebnisse 50
4.1 Patienten 50
4.1.1 Patienten deutscher und schweizer Cystinose Familien 50
4.1.2 Patienten turkischer Cystinose Familien 53
4.2 Identifizierung von Deletionen im Cystinosin Gen 54
4.2.1 Amplifikation des Mikrosatellitenmarkers D17S829 54
4.2.2 Amplifikation Cystinosin Exons 3 12 61
4.2.3 Nachweis heterozygoter 57 kb Deletionen mittels
Segregationsanalyse 64
4.2.4 Nachweis heterozygoter 57 kb Deletionen mittels
Bruchpunkt PCR 66
4.2.5 Differenzierung zwischen 13 kb und 57 kb Deletion 73
Inhaltsverzeichnis
4.3 Nachweis von kleineren Deletionen 75
4.3.1 GACT Deletionen in Exon 3 an Position 357 75
4.3.2 GGT Deletionen in Exon 3 an Position 400 78
4.3.321 bp Deletionen in Exon 5 an Position 537 79
4.4 Kleinere Mutationen im Cystinosin Gen 80
4.4.1 Insertionen 80
4.4.2 Deletion 84
4.4.3 Basensubstitutionen 87
4.5 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse 93
4.5.1 Mutationen deutscher und schweizer Cystinosepatienten 94
4.5.2 Mutationen turkischer Cystinosepatienten 97
5. Diskussion 99
5.1 Mbglicher Einfluss neu identifizierter Mutationen auf die
Cystinosin Struktur und Funktion 99
5.2 Cystinosin Mutationen deutscher, schweizer und turkischer
Patienten im Vergleich mit Mutationen anderer Untersuchungen 106
5.3 Gibt es eine Genotyp Phanotyp Korrelation ? 109
5.4 Ausblick 112
6. Zusammenfassung 116
7. Literatur 118
8. Anhang 128
8.1 Sequenzen 128
8.2 Danksagung 133
8.3 Eigene Publikationen im Rahmen dieser Arbeit 135
8.3.1 Publikationen 135
8.3.2 Vortrage 135
8.3.3 Abstracts/Poster 135
8.4 Curriculum Vitae 137
8.5 Ehrenwbrtliche Erklarung 138
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