Urothelkarzinome des oberen Harntrakts mit Mutator-Phänotyp-: molekulare Hinweise für einen spezifischen Entstehungsweg
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|---|---|
| adam_text | 1 EINLEITUNG 4
1.1 Prädisposition zu Krebserkrankungen am Beispiel des HNPCC. 4
1.1.1 Das Mismatch Repair System MMR. 5
1.1.1.1 Funktionsweise des MMR. 6
1.1.1.2 Funktionsverlust des MMR. 7
1.1.2 Klinik des HNPCC-Syndroms 7
1.1.3 HNPCC und Mikrosatelliteninstabilität 8
1.2 Tumorpathologie des Urothelkarzinoms des oberen Harntrakts. 9
1.2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Urothelkarzinoms 10
1.2.2 Risikofaktoren für Tumoren des oberen Harntraktes 12
1.3 Molekulargenetik des Urothelkarzinoms. 13
1.3.1 Onkogene 13
1.3.2 Tumorsuppressorgene 14
1.3.3 p53 und Karzinogenese 15
1.3.4 Mehrstufenmodell der Entstehung des Urothelkarzinoms 16
2 HINTERGRUND UND FRAGESTELLUNG 18
3 MATERIAL .19
3.1 Laborgeräte 19
3.2 Chemikalien 20
3.3 Antikörper für die immunhistochemischen Färbungen. 20
3.4 Pufferund Lösungen 21
3.5 Daten des Patientenkollektivs 26
4 METHODEN 28
4.1 DNA-Isolierung aus Paraffingewebe 28
4.1.1 Herstellung von Paraffinschnitten 28
4.1.2 Entparaffinieren der Schnitte für die Mikrodissektion oder HE-Färbung. 28
4.1.3 HE-Färbung der Schnitte 28
4.1.4 Mikrodissektion der Normalgewebs-und Tumorareale. 29
4.1.5 Proteinase-K-Verdau und Isolierung der DNA 29
4.2 LOH-Analyse 30
4.2.1 DNA-Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) 30
4.2.1.1 Funktionsweise der PCR. 30
4.2.1.2 Ermittlung der Anncalingtempcratur der Primer durch die Gradienten-PCR. 30
4.2.1.3 Verwendung von Mikrosatellitenprimem in der LOH-Analyse. 31
4.2.1.4 Ansatz und Programm der PCR in der LOH-Analyse. 31
4.2.1.5 Einsatz der PEP-PCR zur Amplifikation des gesamten Genoms. 32
4.2.1.6 PCR und Kontamination. 33
4.2.2 Darstellung der PCR-Produkte auf dem PAA-Gel 33
4.2.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAGE). 33
4.2.2.2 Silberfärbung des PAA-Gels. 34
4.2.2.3 Interpretation der Banden auf silbergefärbten PAA-Gelen. 35
4.2.2.3.1. Heterozygotie 35
1
4.2.2.3.2. Homozygotie oder fehlende lnformativität des Primers 35
4.2.2.3.3. LossofHeterozygosity (LOH). 35
4.2.2.3.4. Mikrosatelliteninstabilität 36
4.3 Sequenzierung der Exon 5-8 des p53-Gens. 36
4.3.1 Amplifikation der DNA mit Hilfe der NestedPCR. 37
4.3.2 PEG-Fällung der PCR-Produkte 37
4.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 37
4.3.4 Sequenzreaktion nach Sanger. : 38
4.3.5 Ethanolfällung der Produkte der Sequenzreaktion 39
4.3.6 Detektion der Fluoreszenzsignale durch den ABI PRISM 373 A. 39
4.3.7 Auswertung der Chromatogramme 40
4.4 Prinzip der immunhistochemischen Färbung: 40
4.4.1 Protokoll der immunhistochemischen Färbungen: 40
4.4.2 Statistische Auswertung 41
5 ERGEBNISSE AI
5.1 Reproduzierbarkeit und Verwertbarkeit der Methoden. 42
5.1.1 Aussagekraft der LOH-Analyse 42
5.1.2 Überprüfung der Ergebnisse der p53-Sequenzierung. 42
5.2 Verwendete Primer. 43
5.3 Ergebnisse der LOH-Analyse. 44
5.3.1 Heterozygote Deletionen 44
5.3.2 Homozygote Deletionen 46
5.4 Häufigkeit mikrosatellitenstabiler und -instabiler Tumoren. 46
5.5 Chromosomale Instabilität vs. Mikrosatelliteninstabilität 47
5.5.1 LOH bei Nierenbeckenkarzinomen 47
5.5.2 LOH bei Ureterkarzinomen 48
5.5.3 Unterschiedliche LOH-Raten bei MSS-, MSI-L und MSI-H-Tumorea 48
5.5.4 MSI in der LOH-Analyse 49
5.6 Ergebnisse der p53-Sequenzierung. 50
5.6.1 p53-Mutation und Mikrosatelliteninstabilität 53
5.7 Ergebnisse der Immunhistochemie. 53
5.7.1 Ergebnisse der CK20-Färbung 55
5.7.2 Ergebnisse der p53-Färbung. 56
5.7.3 Ergebnisse der Ki-67-Färbung mit MIB-1 58
5.8 Korrelation der Ergebnisse mit den histopathologischen Daten. 58
5.8.1 Korrelation der Histopathologie mit der Mikrosatelliteninstabilität 59
5.8.2 Korrelation der p53-Alteration mit der Histopathologie 61
5.8.3 Ergebnisse der Immunhistochemie in Korrelation zu der Histopathologie 63
5.8.3.1 Ergebnisse deT CK20-Färbung und die Histopathologie. 64
5.8.3.2 Ergebnisse der p53-Färbung und die Histopathologie.... 64
5.8.3.3 Ergebnisse der Kj-67 (MIB-1 )-Färbung und die Histopathologie. 64
6 DISKUSSION j66
6.1 Methodische Probleme. 66
6.1.1 Negative Ergebnisse in der PCR-Reaktioa ™. ™3! ZZ~™Z ™ 66
6.1.2 Probleme bei der p53-Sequenzierung 67
6.2 LOH auf Chromosom 9 und 17 beim Urothelkarzinom. 67
6.3 Chromosomale (CIN) vs. Mikrosatelliteninstabilität (MSI). 68
6.4 MSI und CIN in Tumoren des oberen Harntrakts. 69
6.5 Zwei Entstehungswege zum Urothelkarzinom. 71
6.6 Deletionen auf Chromosom 9 in OHT-Tumoren. 72
6.7 Alterationen von p53 74
6.7.1 p53-Mutationen und Deletionen des Chromosomenarms 17p 74
6.7.2 p53-Alterationen in Korrelation mit Tumorgrad und Stadium 74
6.7.3 p53-Alterationen und Mikrosatelliteninstabilität 75
6.7.4 p53-Mutationen in mikrosatellitenstabilen und -instabilen Tumoren. 75
6.8 Immunhistochemische Unterschiede zwischen mikrosatellitenstabilen und -instabi¬
len Tumoren.... 76
6.8.1 Cytokeratin 20 (CK 20)-Expression 76
6.8.2 p53-Expression 76
6.8.3 Ki-67-Expression(MIB-l) 77
6.9 Invertiertes Wachstum. 78
6.10 Übersicht über die Unterschiede zwischen mikrosatelliteninstabilen und
-stabilen Tumoren 78
6.11 Verschiedene Mechanismen der Krebsentstehung im Urothelkarzinom des obe¬
ren Harntrakts und ihre histopathologischen Eigenheiten. 79
6.12 Ausblick: Hinweise auf „target genes der genomischen Instabilität 81
7 ZUSAMMENFASSUNG XI
8 ANHANG -83
8.1 Literaturverzeichnis 83
8.2 Rohdaten 93
8.3 Abkürzungsverzeichnis 97
9 DANKSAGUNG 58
10 LEBENSLAUF 59
3
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