Modulation molekularer Mechanismen der Stickstoffmonoxid-Synthese in zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen nach Stimulation mit Zellwänden von Streptococcus pneumoniae:
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Autor: Manz, Rahel
Jahr: 2004
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1. EINLEITUNG
1.1. Klinischer Hintergrund 1
1.2. Der Erreger: Streptococcus pneumoniae 2
1.3. Funktion und Charakteristika zerebraler mikrovaskulärer Endothel- 5
zellen
1.4. Das Stickstoffmonoxid (NO) 7
1.4.1. Enzymatische Bildung von NO 8
1.4.2. Die induktive NO-Synthase 10
1.5. Rolle des NO bei der bakteriellen Meningitis 12
1.6. Zielstellung und Hypothesen 14
2. MATERIALIEN UND METHODEN
2.1. Kultur der zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen 15
2.2. Charakterisierung der zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen 17
2.2.1. Immunzytochemische Färbung 17
2.2.2. RT-PCR fürGFAPundCD14 18
2.3. Stimulation der zerebralen mikrovaskulären Endothelzellkulturen 19
2.4. Bestimmung des freigesetzten Stickstoffmonoxids mittels Griess - 21
Reaktion
2.5. Detektion der induktiven NO-Synthase mittels Westernblot 22
2.6. Die kompetitive Reverse Transkriptase Polymerase-Ketten- 25
Reaktion
2.6.1. RNA-Extraktion 27
2.6.2. Reverse Transkription 27
2.6 3. Auswahl der Primer 29
2.7. Herstellung der Deletionsstandards 30
2.7.1. Herstellung des GAPDH-Deletionsstandards mittels Linkerprimer-PCR 30
2.7.2. Subklonierung des PCR-Produktes in den pCR ™ll Vektor 33
2.7.3. Herstellung des iNOS-Deletionsstandards 34
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.4. Identifikation der Deletionsstandards mittels der Cycle Sequencing- 34
Methode
2.8. Die kompetitive RT-PCR 34
2.8.1 Optimierung der RT-PCR 34
2.8.2. Durchführung der RT-PCR 36
2.9. Statistik 38
3. ERGEBNISSE
A. Methodische Aspekte
3. 1. Charakterisierung der zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen 39
3.1.1. Mikroskopischer und immunzytochemischer Nachweis 39
3.1.2. Überprüfung des Reinheitsgrades der Endothelzellkulturen mittels 41
CD 14undGFAP-PCR
3.2. Optimierung der kompetitiven iNOS-PCR 42
3.2.1. Einfluß der Magnesium-Chlorid-Konzentration 42
3. 2. 2. Bestimmung der optimalen 4A7nea///70f-Temperatur 43
3.3. Herstellung des GAPDH-Deletionsstandards 43
3. 4. Vergleich der Amplifikatdetektion der kompetitiven RT-PCR 44
zwischen DNA-Sequenziergerät und Argarosegel
B. Ergebnisse der Stimulationsexperimente
3. 5. iNOS mRNA-Expression in und die NO-Freisetzung aus BMEC ist 46
abhängig von der PCW-Dosis
3. 5. 1. Abhängigkeit der iNOS-mRNA- Expression von der PCW-Dosis 46
3. 5. 2. Abhängigkeit der NO-Freisetzung von der PCW- Dosis 47
3. 6. Zeitverlauf der Expression der iNOS-mRNA, des iNOS-Proteins 48
und der NO-Synthese aus BMEC nach PCW-Stimulation
3. 6. 1. Zeitverlauf der iNOS-mRNA-Expression 48
3. 6. 2. Zeitverlauf der iNOS-Proteinsynthese 49
3. 6. 3. Zeitverlauf der NO-Freisetzung 50
3.7. Pharmakologische Blockade der NO-Synthese 50
3. 7. 1. Beeinflussung der NO-Freisetzung durch unspezifische und 51
spezifische Inhibitoren von NF-kB
INHALTSVERZEICHNIS
3. 7. 2. Hemmung der NO Freisetzung durch unspezifische und spezifische 52
Inhibitoren der induktiven NO-Synthase
3. 7. 3. Die NO-Freisetzung wird durch TNF-oc beeinflußt 53
4. DISKUSSION
A. Methodische Aspekte 54
4.1. Primärkulturen der zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen 54
4.2. Kompetitive RT-PCR 55
4.2.1. Kompetitive RT-PCR zur Quantifizierung von mRNA 55
4.2.2. Elimination möglicher Fehlerquellen bei der Quantifizierung der mRNA 55
mittels der kompetitiven RT-PCR
B. Ergebnisse der Stimulationsexperimente 57
4.3. Einfluss der PCW und Rolle der BMEC bei der NO-Freisetzung 58
während der bakteriellen Meningitis
4.3.1. PCW-Dosis- und Zeit-Abhängigkeit der iNOS-mRNA-Expression und 59
NO-Synthese aus BMEC
4.3.2. Zusammenhang zwischen NO-Freisetzung und TNF-oc 60
4.3.3. Pharmakologische Interventionen 61
4.3.3.1. Die NO-Freisetzung in BMEC ist NF-kB abhängig und kann durch 62
SN50, Pyrrolidindithiocarbamat u. Dexamethason supprimiert werden
4.3.3.2. Inhibitoren der iNOS 63
4-4. Ausblick auf mögliche adjuvante Therapieansätze der Pneumo- 64
kokkenmeningitis in der Klinik
5. ZUSAMMENFASSUNG 66
6. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 69
7. LITERATURVERZEICHNIS 71
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
PUBLIKATIONEN
CURRICULUM VITAE
DANKSAGUNG
INHALTSVERZEICHNIS
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