Zellzyklus regulierende Funktion der Mammalian-STE20-like-Kinase-1 (MST1):
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| adam_text | Inhalt
JL ZUSAMMENFASSUNG l
g, EINLEITUNG 2
2.1. Zielstellung 3
2.2. Apoptose und Nekrose 4
2.2.1. Allgemeines 4
2.2.2. Nekrose 4
2.2.3. Apoptose 5
2.2.3.1. Caspasen 6
2.2.3.1.1. Induktion von AUßEN 6
2.2.3.1.2. Induktion von innen 7
2.2.3.2. Caspasen unabhängige Apoptose 7
2.2.3.3. Viren und Apoptose 8
2.3. Zellzyklusregulation 9
2.3.1. Der G l /s Checkpoint und p5 3 12
2.3.2. Der G2/M Checkpoint 13
2.4. MITOGEN ACTIVATED PROTEINKINASE (MAPK) 14
2.5. JNK 15
2.5.1. P38 15
2.6. MST1 17
2.7. rnaintereference 20
2.7.1. Hintergrund 20
2.7.2. Mechanismus 21
2.7.2.1. initiierungsschritt 21
2.7.2.2. effektorschritt 22
2.7.2.3. biologische Funktion von RNAi 23
2.7.2.4. Ausblick 24
3. MATERIAL UND METHODEN 26.
3.1. Zellkultur 26
3.1.1. Methode 26
3.1.2. Material 27
3.2. Bestimmung der Lebend Zellzahl mit Trypan Blau 27
3.2.1. Methode 27
3.2.2. Material 28
3.3. Vorbereitung der Proben für Western Blot 28
3.3.1. Methode 28
3.3.2. Material 28
3.4. bradford assay 29
3.4.1. Methode 29
3.4.2. Material 29
3.5. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese 29
3.5.1. Methode 30
3.5.2. Probenvorbereitung 31
IV
3.5.3. Materialien 31
3.6. Western Blot und Entwicklung mit ECL 32
3.6.1. Prinzip 32
3.6.2. Methode 33
3.6.2.1. Transfer 33
3.6.2.2. Blocken und Waschen 33
3.6.3. Auswertung der Blots 34
3.6.4. Verwendete Materialien 34
3.7. durchflusszytometrie (facs) 35
3.7.1. Prinzip 35
3.7.2. Methode 36
3.7.3. Material 36
3.8. annexin v färbung 36
3.8.1. Prinzip 36
3.8.2. Methode 36
3.8.3. Material 37
3.9. Behandlung mit Wasserstoffperoxid H2O2 38
3.9.1. Methode 38
3.9.2. Material 38
3.10. UV Bestrahlung 38
3.10.1. Methode 38
3.10.2. Material 39
3.11. Etoposid Behandlung 39
3.11.1. Methode 39
3.11.2. Material 39
3.12. rnainterference 40
3.12. l. Richtlinien für RNAi Design 40
3.12.2. Methode 42
3.12.3. Materialien 44
3.13. PARP Blot 44
3.13.1. Methode 44
3.13.2. Material 44
3.14. Statistik 45
4. ergebnisse 46
4.1. Auswahl der Zelllinie 46
4.2. RNAi VORVERSUCHE 47
4.2.1. Zeitverlauf und Konzentrationsermittelung 47
4.2.2. Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeit unter RNAi Einfluss 50
4.3. Vorversuche ohne RNAi 53
4.3.1. uv induzierte apoptose und nachweis durch anti parp blot 53
4.3.2. H2o2 induzierte Apoptose und Nachweis durch Anti PARP Blot 56
4.3.3. Etoposid induzierte Apoptose Nachweis durch Annexin V 58
4.4. mst1 supprimierte zellen mit verschiedenen stressstimuli 59
4.4.1. uv induzierte apoptose nachweis der apoptose mittels
durchflusszytometrie 59
4.4.2. uv induzierte apoptose nachweis mittels anti parp blot 60
4.4.2.1. 24 Sunden nach UV Bestrahlung 60
4.4.2.2. 48 Sunden nach UV Bestrahlung 62
4.4.2.3. 72 Sunden nach UV Bestrahlung 64
4.4.3. Wachstum nach UV Bestrahlung 66
4.4.4. Bilder der Zellen nach RNAi und UV 70
V
5» DISKUSSION 71
5.1. Diskussion der RNAi Vorversuche 71
5.1.1. Versuche mit verschiedenen Zelllinien 71
5.1.2. zeitverlauf und konzentrationsermittlung 71
5.1.3. Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeit 73
5.2. Diskussion der Vorversuche ohne RNAi: 73
5.2.1. uv induzierte apoptose und apoptose 74
5.2.2. h2o2 induzierte apoptose und apoptose 75
5.2.3. etoposid induzierte apoptose 76
53. Diskussion der RNAi Versuche mit Stressstimuli 77
5.3.1. uv induzierte apoptose nachweis durch annexin v 77
5.3.2. uv induzierte apoptose nachweis durch anti parp blot 77
5.3.3. Wachstum nach UV Bestrahlung 79
5.4. abschließende diskussion 80
5.5. Ausblick und Kritik der eigenen Arbeit 84
6* SCHLUSSFOLGERUNGEN §£
L METHODENTRANSFER 88
7.1. RNAi FÃœR HLA G 88
8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 82
2, LITERATUR 21
iq. anhang
Danksagung
Lebenslauf
Ehrenwörtliche Erklärung
VI
Abbildungsverzeichnis
8. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Schematischer Ablauf des Zellzyklus 9
Abbildung 2 Darstellung der wichtigsten p53 abhängigen Signalwege nach DNS
Schädigung 12
Abbildung 3 Modell des MAPK Systems 14
Abbildung 4 Modell des MST1 Proteins 17
Abbildung 5 MST1 Modell nach Ura et al 18
Abbildung 6 Modell des RNAi Mechanismus 22
Abbildung 7 Risc als variables Modul in der Zelle 23
Abbildung 8 Alignment der MST 1 Sequenz 41
Abbildung 9 Ausschnitt des MST 1 siRNA BLAST bei PubMed 42
Abbildung 10 Anti MSTl Blot 36 h nach Applikation der RNAi Oligos 47
Abbildung 11 Anti MSTl Blot 60 h nach Applikation der RNAi Oligos 48
Abbildung 12 Anti MSTl Blot 80 h nach Applikation der RNAi Oligos 49
Abbildung 13 Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeit 50
Abbildung 14 Aufnahmen der Heia Zellen nach siRNA Applikation 52
Abbildung 15 Anti PARP Blot 24 h nach UV Bestrahlung 53
Abbildung 16 Verhältnis von „cleaved PARP zu „uncleaved PARP 24 h nach UV^
Bestrahlung
Abbildung 17 Heia Zellen 24 Stunden nach 30 J/m2 UV Strahlung 57
Abbildung 18 Anti PARP Blot 48 h nach H2O2 Einfluss 56
Abbildung 19 Verhältnis von cleaved PARP zu uncleaved PARP 48 h nach H2O2 ^
Einfluss
Abbildung 20 Annexin positive Heia Zellen nach Einfluss von Etoposid 58
Abbildung 21 Annexin positive Heia Zellen 24 h nach UV Bestrahlung 59
89
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 22 Verhältnis von cleaved PARP zu uncleaved PARP 24 h nach UV
Bestrahlung und 48 h nach RNAi Applikation 60
Abbildung 23 Anti MST 1 Blot 24 h nach UV Bestrahlung und 48 h nach RNAi
Applikation 61
Abbildung 24 Verhältnis von cleaved PARP zu uncleaved PARP 48 h nach UV
Bestrahlung und 72 h nach RNAi Applikation 62
Abbildung 25 Anti MST 1 Blot 48 h nach UV Bestrahlung und 72 h nach RNAi
Applikation 63
Abbildung 26 Verhältnis von cleaved PARP zu uncleaved PARP 72 h nach UV
Bestrahlung und 96 h nach RNAi Applikation 64
Abbildung 27 Anti MST 1 Blot 72 h nach UV Bestrahlung und 96 h nach RNAi
Applikation 65
Abbildung 28 Relative Zellzahlen nach UV Bestrahlung mit 10 J/m2 66
Abbildung 29 Anti MST 1 Blot 24 h nach RNAi und 0 h nach Bestrahlung mit 10
J/m2 UV 67
Abbildung 30 Anti MST 1 Blots 48 h nach RNAi und 24 h nach Bestrahlung mit 10
J/m2 UV 68
Abbildung 31 Anti MST 1 Blots 72 h nach RNAi und 48 h nach Bestrahlung mit 10
J/m2 UV 69
Abbildung 32 Aufnahmen der mit siRNA und UV Strahlung behandelten Zellen 70
Abbildung 33 Funktion von p53 unter Berücksichtigung von MST1 81
Abbildung 34 modifiziertes Modell der Funktion von MST1 82
Abbildung 35 HLA G Blot nach RNAi 87
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