Untersuchung zum Einfluß der Aktivierung des Thrombinrezeptors PAR-1 auf Poteinkinase-A in humanen SNB-19-Glioblastomzellen:
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INHALT
INHALT
1. EINLEITUNG 1
1.1. S ERINPROTEASE THROMBIN 1
1.1.1. STRUKTUR DES THROMBINS 1
1.1.2. PROTHROMBINAKTIVIERUNG 3
1.1.3. F UNKTION DES THROMBINS 5
1.2. THROMBINREZEPTOR PAR-1 7
1.2.1. PROTEASE-AKTIVIERTEN REZEPTOREN 7
1.2.2. STRUKTUR VON PAR-1 9
1.2.3. AKTIVIERUNG UND SIGNALTERMINIERUNG VON PAR-1 10
1.2.4. PAR-1-GEKOPPELTE SIGNALWEGE 12
1.2.5. FUNKTION VON PAR-1 _ 12
1.3. PROTEINKINASE A 14
1.3.1. STRUKTUR DER PROTEINKINASE A 14
1.3.2. AKTIVIERUNG DER PROTEINKINASE A 16
1.3.2.1. CAMP-ABHAENGIGE PKA-AKTIVIERUNG 16
1.3.2.2. CAMP-UNABHAENGIGE PKA-AKTIVIERUNG 17
1.3.3. FUNKTION DER PROTEINKINASE A 18
1.4. NUCLEAR FACTOR-KAPPA B
(NF-KB) 19
1.4.1. STRUKTUR VON
NF-KB 20
1.4.2. AKTIVIERUNG VON
NF-KB 20
1.4.3. FUNKTION VON
NF-KB 23
2. ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 24
3. MATERIAL UND METHODEN 25
3.1. MATERIAL 25
3.1.1. CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 25
3.1.2. ZELLEN 29
3.1.3. PEPTIDE 29
3.1.4. GERAETE 29
3.1.5. PUFFERLOESUNGEN 31
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALT
3.2. METHODEN 33
3.2.1. ZELLKULTUR 33
3.2.2. ZELLZAHLBESTIMMUNG 33
3.2.3. ISOLIERUNG VON MRNA 33
3.2.4. EINZEISTRANG-CDNA-GEWINNUNG AUS MRNA 34
3.2.5. POLYMERASE-KETTENREAKTION 34
3.2.6. IMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNG 35
3.2.7. BESTIMMUNG DER FREIEN INTRAZELLULAEREN KALZIUMKONZENTRATION 36
3.2.8. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 36
3.2.9. KEMFRAKTIONIERUNG 37
3.2.10. DISKONTINUIERLICHE SDS-PAGE UND WESTERN BLOT 37
3.2.11. ENZYMATISCHE AKTIVITAET VON PROTEINKINASE A 38
3.2.12. BESTIMMUNG DER CAMP-KONZENTRATION _ 39
3.2.13. CO-IMMUNPRAEZIPITATION 40
3.2.14. BESTIMMUNG DER PROLIFERATION 41
4. ERGEBNISSE 42
4.1. UNTERSUCHUNG VON SNB-19-ZELLEN AUF IHRE AUSSTATTUNG MIT PAR-TYP-
THROMBINREZEPTOREN 42
4.1.1. TLIROMBINREZEPTOR-MRNA EXPRESSION 42
4.1.2. NACHWEIS VON PAR-1 DURCH IMMUNFLUORESZENZUNTERSUCHIMG 43
4.1.3. FUNKTIONELLER REZEPTOMACHWEIS DURCH UNTERSUCHUNG DER
KALZIUMMOBILISIERUNG 44
4.2. UNTERSUCHUNG DER PROTEINKINASE A-AKTIVIERUNG IN SNB-19-ZELLEN 46
4.2.1. PROTEINKINASE A IN DER KEMFRAKTION 46
4.2.2. ENZYMATISCHE AKTIVITAET VON PROTEINKINASE A 47
/
4.2.3. INTRAZELLULAERE CAMP-KONZENTRATION 49
4.3. PROTEINKINASE A UND TRANSKRIPTIONSFAKTOR
NF-KB 50
4.3.1. NF-KB-A
KTIVIERUNG 50
4.3.2. CO-IMMUNPRAEZIPITATION VON PKA,
NF-KB UND IKB 52
4.4. UNTERSUCHUNGEN ZUR BEDEUTUNG DER PAR-1-VERMITTELTEN PKA-AKTIVIERUNG
AUF ZELLULAERER EBENE 53
II
INHALT
5. DISKUSSION 55
5.1. SNB-19-GLIOBLASTOMZELLEN - EIN GEEIGNETES MODELL ZUR UNTERSUCHUNG
DES PAR-1 -TYP-THROMBINREZEPTORS 5 5
5.2. PAR-1 VERMITTELT EINE PROTEINKINASE A-AKTIVIERUNG IN SNB-19-ZELLEN
56
5.3. PAR-1 HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE INTRAZELLULAERE CAMP-KONZENTRATION
57
5.4. BETEILIGUNG EINES NF-KB-LKB-C(
PKA)-KOMPLEXES AN DER PAR-1-VERMITTELTEN
PKA-AKTIVIERUNG 57
5.4.1. ASSOZIATION DER KATALYTISCHEN PKA-UNTEREINHEIT
C(PKA) AN DEN
NF-ICB-IICB-KOMPLEX 57
5.4.2. PAR-1-VERMITTELTE FREISETZUNG VON
C(PKA) AUS EINEM NF-KB-
LKB-C(
PKA)-KOMPLEX 58
5.5. BEDEUTUNG DER PAR-1-VERMITTELTEN PKA-AKTIVIERUNG AUF ZELLULAERER
EBENE 59
5.6. AUSBLICK 60
6. LITERATUR 53
ANHANG 34
ABKUERZUNGEN
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
PUBLIKATIONEN
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
ERKLAERUNG ZUR BEWERBUNG
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