Untersuchungen zur Signalkompetenz paarungsunfähiger und paarungsfähiger [my]-schwerer Immunglobulinketten in Abwesenheit von leichten Ketten:
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2004
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1 Die Entwicklung von B-lymphoiden Zellen 2
2.2 Die Struktur des Prä-BZRs 5
2.3 Ungepaarte pH-Ketten in der B-Zellentwicklung 6
2.4 Die Stressantwort im endoplasmatischen Retikulum (UPR) 8
2.5 Die Plasmazelldifferenzierung 12
2.5.1 Die Regulation der Plasmazelldifferenzierung 13
2.5.2 Die Beteiligung des UPR an der Plasmazelldifferenzierung 14
3. Fragestellung 16
4. Ergebnisse 17
4.1 Untersuchungen zur Signalkompetenz einer paarungsunfähigen pH-Kette
in Anwesenheit von paarungsfähigen endogenen pH-Ketten 17
4.1.1 Einfluss einer paarungsunfähigen pH-Kette (81XFpH) auf die
Entwicklungen Milz-B-Zellen 18
4.1.2 Einfluss einer paarungsunfähigen pH-Kette (81XFpH) auf die
frühe B-Zellentwicklung 20
4.1.3 Expression der 81 XFpH-Kette in frühen Stadien der B-Zellentwicklung 22
4.1.4 Einfluss der paarungsunfähigen 81XFpH-Kette auf den UPR 25
4.2 Untersuchungen zur Signalkompetenz einer paarungsfähigen pH-Kette
in Abwesenheit der SL-Kettenkomponente X.5 und einer
konventionellen IgL-Kette 29
4.2.1 Experimentelles System:
Tetrazyklin-kontrollierte Expression der pH-Kette 29
4.2.1.1 Induktion der pH-Kette 31
4.2.1.2 Charakterisierung von dTg/RAG27X5*- und dTg/RAG27X5 -Mäusen 32
4.2.2 Einfluss einer paarungsfähigen pH-Kette in Abwesenheit von X5 auf
die Entwicklung B-lymphoider Vorläuferzellen in vivo 33
4.2.3 Einfluss einer paarungsfähigen pH-Kette auf das Zellwachstum und
das Überleben X5-defizienter Zellen 35
4.2.4 Einfluss einer paarungsfähigen pH-Kette in Abwesenheit von X5
auf den UPR 38
4.2.5 Nachweis der pH-Ketten-Expression in Abwesenheit von X5
auf der Oberfläche 40
4.3 Untersuchungen zur Induktion des UPR durch erhöhte pH-Ketten-Synthese 42
4.3.1 Experimentelles System 43
4.3.2 Induktion der pH-Kette 44
4.3.3 Sekretion der pH-Kette 45
4.3.4 Glykosylierung immunpräzipitierter pH-Ketten 45
4.3.5 Einfluss der pH-Kette auf den UPR 47
4.3.5.1 Analyse der Induktion von Chaperonen nach Synthese der pH-Kette 47
4.3.5.2 uH-Ketten-vermitteltes Spleißen von XBP-1 51
4.3.5.3 Aktivierung des PERK-Signalweges nach Induktion der pH-Kette . . 52
Inhaltsverzeichnis
4.3.5.4 Einfluss der induzierbaren pH-Kette auf den Zellzyklus 55
4.3.5.5 Analyse der Induktion von Apoptose nach Synthese der uH-Kette
in Gegenwart zusätzlicher Stressfaktoren 56
4.3.5.6 Aktivierung der ERAD-Komponente HRD1 durch die uH-Kette .... 57
4.3.5.7 Ubiquitinylierung der uH-Kette 58
5. Diskussion 61
6. Material und Methoden 76
6.1. Reagenzien und Laborhilfsmittel 76
6.1.1 Zellen und Zeil-Linien 76
6.1.2 Bakterien 78
6.1.3 Plasmide 78
6.1.4 Oligonukleotide 78
6.1.5 Antikörper 79
6.1.6 Versuchstiere 81
6.2 Zellkulturverfahren 81
6.2.1 Kultivierung von Pro-B-Zellen 81
6.2.2 Kultivierung von HeLa-Zellen 81
6.2.3 Kryokonservierung von Zellen 82
6.2.4 Auftauen von Zellen 82
6.2.5 Mikroskopische Zellzahlbestimmung 82
6.3 Präparation von Zellsuspensionen aus lymphatischen Organen der Maus . . 83
6.3.1 Präparation der Milz 83
6.3.2 Präparation von Knochenmark 83
6.3.3 Lyse der Erythrozyten 83
6.3.4. Isolierung von murinen B-lymphoiden Zellen aus
Knochenmarkszellsuspensionen mit Magnetic Cell Sorting [MACS) 84
6.4 Durchflusszytometrische Analysen von Zellen 84
6.4.1 Bestimmung der Zellzahl 84
6.4.2 Zellzyklus-Analyse 84
6.4.3 Analyse von Oberflächenmolekülen 85
6.4.5 Induktion von Apoptose in HeLa-Zellen 85
6.5 Analyse von DNA und RNA 86
6.5.1 DNA-Standardmethoden 86
6.5.2 Transformation von Bakterien mittels der Hitzeschock-Methode .... 87
6.5.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien 87
6.5.4 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 87
6.5.5 DNA-Sequenzierung 87
6.5.6 Genotypisierung von transgenen Mäusen 88
6.5.6.1 Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwänzen 88
6.5.6.2 PCR-Analyse von Mausschwanz-DNA 88
6.5.6.3 Southern-Blot-Analyse von Mausschwanz-DNA 89
6.6 RNA-Methoden 89
6.6.1 Isolierung von zellulärer RNA 89
Inhaltsverzeichnis
6.7.2 Synthese von cDNA 89
6.6.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 89
6.6.4 Quantitative PCR 90
6.7 Allgemeine Protein-Methoden 91
6.7.1 SDS-PAGE 91
6.7.2 Herstellung von Zellextrakten für Westem-Blot-Analysen 92
6.7.3 Nachweis sezernierter uH-Ketten im Zellkulturüberstand 92
6.7.4 Immunpräzipitation 93
6.7.5 Endoglykosidase-H-Verdau 93
6.7.6 Western-Blot-Analyse 94
7. Abkürzungen 96
8. Literatur 99
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